线粒体凋亡途径在DNA-PKcs抑制肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu凋亡中的作用研究

余春波，李大玉，范 芳，刘喜平，陆红玲，刘 云，李长福

(1.遵义医科大学 生物化学与分子生物学教研室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学 医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099)

肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一。肝癌的治疗有手术、化疗等，而多药耐药(multidrug resistance,MDR)的产生是肝癌化疗失败的主要原因。DNA依赖蛋白激酶催化亚基(the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)是DNA依赖蛋白激酶的催化亚单元，属于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)家族，可通过自身磷酸化或磷酸化下游分子参与细胞内的各种生物学活动，包括参与DNA修复、细胞凋亡途径的信号传导等[1-3]。课题组前期研究发现，shDNA-PKcs干扰质粒能抑制BEL7402/5-Fu细胞中DNA-PKcs的表达[4]，抑制DNA-PKcs表达能增强肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu对化疗药物的敏感性[5],沉默DNA-PKcs的表达能促进肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu的细胞凋亡[6]，但其机制尚不清楚。本研究拟观察DNA-PKcs沉默后对肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu凋亡及其机制的影响，探讨DNA-PKcs在肝癌耐药中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 BEL7402/5-Fu细胞株购于南京凯基生物科技发展有限公司；siRNA寡核苷酸购于上海吉玛基因生物技术有限公司；RNAiMAX、DAPI、Alexa Fluor594、Alexa Fluor 488购买于Invitrogen公司；Hoechst 33342染色液购自北京索莱宝科技有限公司；DNA-PKcs、细胞色素C、粒体抗体购于英国Abcam公司；AIF、Bax、caspase-3和β-actin抗体购买于Proteintech公司，其它试剂为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 耐药细胞培养 将BEL7402/5-Fu细胞培养在含有10%FBS的1640培养液中，在37℃、5%的CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 实验分组与转染 实验分为空白对照组、siRNA-NC组、RNAiMAX脂质体组和siRNA-DNA-PKcs实验组。空白对照组加无血清培养基，siRNA-NC组加无血清培养基、RNAiMAX脂质体和阴性siRNA片段，RNAiMAX脂质体组加无血清培养基和RNAiMAX脂质体，siRNA-DNA-PKcs实验组加无血清培养基、RNAiMAX脂质体和siRNA-DNA-PKcs片段。将BEL7402/5-Fu细胞计数后，2×105个细胞/孔接种24孔板， 7×105个细胞/孔6孔板培养， 70%～80%的细胞融合度时进行转染，按说明书配制siRNA-脂质体复合物，并加入对应孔中，4～6 h后换液培养。经镜下荧光观察，计数荧光表达阳性细胞，计算其占总生长细胞百分比，最终得出转染效率约为80%。

1.2.3 Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡 将对数生长期各组BEL7402/5-Fu细胞接种于24孔板，12 h后转染，200 μg/mL 5-Fu的培养基作用各组细胞48 h。弃培养基，PBS清洗3次，吸尽残留液，每孔加入400 μL Hoechst 33342染色液，培养箱避光培养20 min。将染色液吸尽，PBS液洗3次，每次3 min，活细胞工作站镜下观察并拍照。

1.2.4 Western blot检测DNA-PKcs、Bax、AIF和caspase-3蛋白表达情况 提取各组细胞总蛋白，BCA 法定量检测样品蛋白含量。SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜3次，一抗DNA-PKcs(兔抗1∶2 000)、Bax(鼠抗1∶1 000)、AIF(兔抗1∶1 000)、caspase-3(兔抗1∶1 000)孵育过夜(4 ℃)，TBST洗膜3次，加HRP标记的抗兔(1∶2 000)、抗鼠(1∶2 000)二抗孵育2 h(室温)，TBST洗膜3次，ECL发光显色，用Image J软件分析灰度比。

1.2.5 免疫荧光检测细胞色素C释放情况 在24孔板中放入爬片，接种细胞，12 h后转染，用含200 μg/mL 5-Fu的培养液进行培养，48 h后收集爬片，PBS洗3次，每次5 min，用4%的多聚甲醛固定细胞20 min，PBS洗3次，每次5 min，0.1%TritonX-100室温通透10 min，PBS洗3次，每次5 min，山羊血清封闭30 min，加一抗细胞色素C(鼠抗1∶1 000)、线粒体(兔抗1∶800)室温避光孵育3 h，PBST洗3次，每次5 min，避光孵育二抗Alexa Fluor 594(抗兔1∶1 500)、Alexa Fluor 488(抗鼠1∶2 000)30 min，PBST洗3次，每次5 min，DAPI封片、避光4℃保存，镜下观察并拍照。用Image J软件半定量分析荧光强度。

2 结果

2.1 转染siRNA-DNA-PKcs的BEL7402/5-Fu细胞出现细胞凋亡 检测结果(见图1)显示：细胞BEL7402/5-Fu转染siRNA-DNA-PKcs后， Hoechst 33342染色标记细胞核，细胞体积缩小，细胞核边集，呈亮蓝色；对照组细胞无明显差异，呈浅蓝色。这些形态学上的变化，提示细胞出现凋亡现象。

A:Control;B:siRNA-NC;C:RNAIMAX;D:siRNA-DNA-PKcs。图1 形态学观察细胞凋亡(×40)

2.2 转染siRNA-DNA-PKcs后DNA-PKcs、Bax、AIF、caspase-3蛋白水平变化 检测结果(见图2)显示，siRNA-DNA-PKcs实验组与对照组比较，DNA-PKcs蛋白水平下调(P<0.05)，Bax、caspase-3和AIF蛋白水平均上调(P<0.05)。DNA-PKcs蛋白表达下调，说明设计的DNA-PKcs序列能有效沉默。

*：与对照组比较， P<0.05 。图2 沉默DNA-PKcs对DNA-PKcs、caspase-3、Bax、AIF蛋白表达的影响

2.3 细胞色素C、线粒体亚细胞器定位情况 检测结果显示：肝癌细胞BEL7402/5-Fu转染siRNA-DNA-PKcs后，siRNA-DNA-PKcs实验组细胞色素C呈弥散分布于细胞质中，围绕在细胞核周围，半定量分析细胞色素C、线粒体平均光密度均减少，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3～4。

图3 免疫荧光检测细胞色素C释放(×100)

**：与对照组比较， P<0.01。图4 Cyt-c和线粒体的平均光密度

3 讨论

肝细胞癌是全球常见癌症之一。从2005年到2011年，肝癌的5年生存率仅为18%[7]。临床上常采用手术结合放化疗，但长期放化疗容易形成MDR从而影响肿瘤的治疗效果。肿瘤MDR产生的机制复杂多样，如DNA损伤修复能力增强、凋亡通路受阻等[8]。DNA-PKcs参与DNA修复、细胞凋亡信号传导等[9]。不同的细胞活动中DNA-PKcs发挥不同的生物学功能和作用。

Caspase-3是凋亡的关键执行者在细胞凋亡中起着不可替代的作用[10]，caspase-3作为凋亡途径的效应分子，称之为“死亡执行蛋白酶”，在线粒体介导细胞的凋亡途径中受凋亡信号的刺激下，线粒体膜通透性发生改变，致使线粒体内膜蛋白如Cyt-c、AIF等从线粒体释放到细胞质中，引起一系列的酶激反应，继而激活caspase-3，启动级联反应，引起细胞凋亡[11-13]。线粒体凋亡通路在肝癌的发生与发展起着起始、放大的中枢作用[14]。抑制肝癌线粒体凋亡途径可降低HCC细胞对化疗的敏感性，可导致肝癌MDR的发生[15]。课题组前期研究发现，沉默DNA-PKcs能诱导肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu细胞凋亡[6]，但其机制尚不清楚，为进一步观察DNA-PKcs沉默后对肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu凋亡及其机制的影响。本实验沉默DNA-PKcs表达后，Hoechst 33342染色标记形态学上的变化提示细胞出现凋亡现象，表明DNA-PKcs沉默后可导致细胞凋亡；在Bax凋亡因子的作用下，Bax靶向转位聚集线粒体膜，引起线粒体外膜通透性改变，致使Cyt-c和AIF释放外流[16]。免疫荧光检测Cyt-c释放情况，半定量分析结果显示Cyt-c光密度低于对照组，线粒体光密度低于对照组，AIF蛋白表达水平增加，而AIF可增强caspase-3的水解活性，激活caspase级联反应，导致caspase-3蛋白表达上调，进而引起细胞凋亡。本研究中Bax、caspase-3表达水平上调，Cyt-c和AIF外流增多，表明DNA-PKcs沉默后，线粒体膜通透性增加，线粒体凋亡途径参与细胞凋亡过程。

综上所述，本研究结果表明，沉默DNA-PKcs表达后，肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu发生凋亡，促凋亡蛋白Bax表达水平上调，Cyt-c和AIF释放进入细胞质中，caspase-3蛋白表达水平上调，进一步促进细胞凋亡的发生，提示沉默DNA-PKcs表达后可能通过激活线粒体凋亡途径促进肝癌细胞BEL7402/5-Fu凋亡，为肝癌的靶向治疗及耐药的防治提供新的实验依据和策略,其具体机制还需进一步的实验研究。