大麻素2型受体激动剂JWH133对人永生化角质形成细胞体外增殖以及细胞因子表达影响的研究

胡 浩，魏志平，刘彦群

内源性大麻素系统（endocannabinoid system，ECS）是由内源性大麻素、大麻素受体——G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）以及相关的酶所组成的一种具有调节多种生理病理过程的信号系统，ECS在皮肤以及附属器的各种细胞类型中对细胞增殖、分化、凋亡以及细胞因子等产生发挥重要的调节功能[1]。研究发现，大麻素2型受体（cannabinoid type 2 receptor，CB2R）在银屑病皮损的角质形成细胞中大量表达，且主要分布于棘细胞层[2]。大麻素2型受体激动剂JWH133具有抑制肿瘤细胞增殖以及免疫反应的作用[1]。本研究初步揭示了JWH133对HaCaT细胞体外增殖、凋亡以及在肿瘤坏死因子（TNF）-α诱导下细胞表达细胞因子的影响，旨在探索JWH133对角质形成细胞的生物学作用。

1 材料和方法

1.1 细胞、试剂和主要设备

人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）株（上海复祥生物科技有限公司），大麻素2型受体激动剂JWH133（美国Tocris公司），DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），CCK-8试剂盒（上海碧云天生物技术研究所），Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司），TNF-α（美国PeproTech公司），人细胞因子检测试剂盒（美国R&D公司），人白细胞介素（IL）-19、IL-22、IL-23酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（南京福麦斯生物技术有限公司），流式细胞仪（美国BD公司），多功能荧光化学发光成像仪（上海勤翔科学仪器有限公司）。JWH133以二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为50 mmol/L 储存液（DMSO 浓度 ≤ 2‰），-20℃避光保存，使用时用DMEM培养基稀释至工作浓度。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组 HaCaT细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基中，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。待细胞长满瓶底后，以含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，接种于培养瓶内，置培养箱中培养24 h贴壁后，更换无血清、无双抗DMEM培养基，并加入不同浓度JWH133。检测JWH133对HaCaT细胞抑制率以及凋亡率实验中，实验分5组，分别为15、30、60 μmol/L JWH133组、溶媒组（含与60 μmol/L JWH133等体积DMSO的DMEM培养基）、阴性组（只含DMEM培养基）。检测JWH133对TNF-α诱导的HaCaT细胞中有关细胞因子表达中，实验分3组，分别为阴性组（只含DMEM 培 养 基）、 TNF-α 组（含有 20 ng/ml TNF-α DMEM 培养基）、TNF-α+30 μmol/L JWH133 组（先将含有20 ng/ml TNF-α DMEM培养基预处理2 h，再加30 μmol/L JWH133），3组细胞在培养箱中共同培养24 h，为后续实验做准备。

1.2.2 CCK8法检测JWH133对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用 取HaCaT细胞5×104/ml接种于96孔培养板，每孔为 100 μl，置于 37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养24 h待细胞贴壁，实验分组如上所述，每组设4个复孔，分别培养12、24、36 h后终止培养，弃去原培养基，将无血清、无双抗DMEM培养基与CCK-8试剂按10:1比例混匀，每孔加入100 μl混匀液，于培养箱中孵育2 h，酶标仪测定450 nm波长处每孔的吸光度（A值），实验重复3次，计算细胞增殖抑制率，抑制率=（1-给药组A值/阴性对照组A值）×100%。

1.2.3 流式细胞术检测JWH133对HaCaT细胞凋亡的影响 以每孔1×105个细胞接种于6孔板中，待细胞长至70%～80%融合时，按上述实验分组用不同浓度JWH133处理细胞，每组设3个复孔，24 h后以胰蛋白酶处理细胞，约3～5 min后用含血清的培养基终止消化，用预冷的PBS轻轻吹打成单细胞悬液，4℃1 000 r/min离心×5 min后弃上清，重复3次，将各组分别加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞，并分别加入5 μl Annexin V-FITC混匀后加入5 μl碘化丙啶（PI），混匀，室温避光反应5～15 min，在1 h内进行上机检测。

1.2.4 抗体蛋白芯片检测JWH133对HaCaT细胞中细胞因子表达的影响 取对数生长期的HaCaT细胞以每孔1×105个细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁生长后，弃去原培养基，按上述实验分组进行实验。培养24 h后收集各组细胞，提取总蛋白，并检测蛋白浓度。每个样本实验区的微阵列中固定了105种细胞因子的抗体及阳性和阴性对照，每个细胞因子位点重复测定2次。具体操作按照试剂盒的说明书进行，其主要步骤如下：①每张膜加入2 ml Array Buffer孵育1 h做封闭处理。②每个Array单元分别加入200 μg样本稀释液4℃孵育过夜。③洗膜后分别加入稀释过的检测抗体，室温孵育1 h。④洗膜后分别加入链霉亲和素-HRP，室温孵育30 min。⑤洗膜后分别加入1 ml化学显色试剂。⑥化学发光成像仪上显色及数据处理与分析。

表1 不同浓度JWH133作用HaCaT细胞12、24、36 h后对其体外增殖的抑制作用 （±s，n=3）

表1 不同浓度JWH133作用HaCaT细胞12、24、36 h后对其体外增殖的抑制作用 （±s，n=3）

注：A值：吸光度值；与阴性组相比，aP＞0.05；与溶媒组相比，bP＜0.05

组 别 12 h 24 h 36 h A值 抑制率（%） A值 抑制率（%） A值 抑制率（%）阴性组 0.934±0.041 0 1.389±0.026 0 1.677±0.026 0溶媒组 0.920±0.022 a 1.47±2.31 a 1.372±0.031 a 1.24±0.59 a 1.646±0.024 a 1.84±1.45 a 15 μmol/L 0.736±0.021 b 21.02±4.29 b 0.646±0.021 b 53.52±1.47 b 0.429±0.028 b 74.42±1.38 b 30 μmol/L 0.630±0.021 b 32.41±4.26 b 0.396±0.012 b 71.46±0.97 b 0.254±0.018 b 84.85±0.88 b 60 μmol/L 0.486±0.010 b 47.90±3.30 b 0.265±0.018 b 80.92±1.07 b 0.207±0.014 b 87.68±0.76 bimages/BZ_8_1059_407_1106_449.pngimages/BZ_8_1640_406_1687_447.png

1.2.5 双抗体夹心ELISA法检测IL-19、IL-22、IL-23水平 取对数生长期的HaCaT细胞，以每孔1×105个细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁生长后，弃去原培养基，按上述实验分组进行实验。培养24 h后收集各组细胞上清，离心后采用ELISA法检测IL-19、IL-22、IL-23水平，严格按照说明书进行操作，每个样本设置4个复孔，用酶标仪读取450 nm处A值，根据标准曲线计算各组IL-19、IL-22、IL-23的浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示。各组HaCaT细胞增殖抑制率随时间的变化采用重复测量的方差分析。多个均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。抗体芯片结果采用HLIMAGE数据分析软件进行分析，取经过软件系统自动排除背景后每个细胞因子重复点灰度值的平均值（PAIRS）。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 JWH133对HaCaT细胞体外增殖的影响

重复测量的方差分析显示JWH133对HaCaT细胞体外抑制的抑制率有时间依赖性（F= 187.1，P＜0.05）；JWH133对HaCaT细胞体外抑制也有浓度依赖性（F= 2678.9，P＜0.05）；药物浓度和时间之间存在交互效应（F= 1177.4，P＜0.05），说明时间因素的变化趋势随药物浓度不同而不同。15 μmol/L JWH133作用12 h即开始表现出对HaCaT细胞体外抑制作用（图1）。与阴性组相比，各浓度JWH133对HaCaT细胞体外增殖具有抑制作用（P均＜ 0.05，表1），且各浓度JWH133组间比较差异有统计学意义（P均＜ 0.05），JWH133浓度越高，抑制作用越强。随着时间延长，各浓度JWH133对HaCaT细胞增殖的抑制作用亦逐渐增强，12～24 h的抑制率较24～36 h上升更快，故选择24 h作为后续实验的时间点。各时间点溶媒组HaCaT细胞体外抑制率与阴性组相比，差异无统计学意义（P均＞ 0.05）。

2.2 JWH133对HaCaT细胞体外凋亡率的影响

流式细胞仪检测结果显示（表2），15、30、60 μmol/L JWH133作用HaCaT细胞24 h后，早期及中晚期细胞总凋亡率分别为（12.07±0.21）%、（18.13±0.21）%、（21.77±0.40）%，与阴性组（4.34±0.07）%相比差异有统计学意义（P均＜0.05）。溶媒组（4.79±0.06）%与阴性组相比差异无统计学意义（P＞0.05），其中60 μmol/L JWH133组作用最强。

2.3 JWH133对HaCaT细胞有关细胞因子表达的影响

图1 不同浓度JWH133作用HaCaT细胞12、24、36 h后对其体外增殖的抑制作用

表2 不同浓度JWH133作用HaCaT细胞24 h后对细胞凋亡的影响 （±s，n=3）

表2 不同浓度JWH133作用HaCaT细胞24 h后对细胞凋亡的影响 （±s，n=3）

注：与阴性组相比，aP＞0.05；与溶媒组相比，bP＜0.05

组 别 凋亡率（%）阴性组 4.34±0.07溶媒组 4.79±0.06 a 15 μmol/L 12.07±0.21 b 30 μmol/L 18.13±0.21 b 60 μmol/L 21.77±0.40 b

通过抗体芯片检测技术筛查与银屑病相关的细胞因子后发现（图2、3），HaCaT细胞经TNF-α诱导后 IL-19、IL-22、IL-23、瘦素（leptin）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、单核细胞趋化因子（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN或 CD147）表达均有不同程度增加，其中IL-19表达明显增加，JWH133处理TNF-α诱导后的各细胞因子总体表达量下降，其中IL-19、IL-22、IL-23、leptin、LIF、MCP-1、MIF表达均低于阴性组中相对应的细胞因子表达量。通过双抗体夹心ELISA法进一步验证其结果的可靠性，结果见表3。阴性组中IL-19、IL-22、IL-23均有微量的分泌，分别为（53.269±9.439）pg/ml、（28.676±2.667）pg/ml、（19.695±3.668）pg/ml，经 TNF-α 诱 导 后 3种因子分泌不同程度的增加，分别为增加至（88.800±16.064）pg/ml、（49.994±5.214）pg/ml、（25.584±1.987）pg/ml，加入 30 μmol/L JWH133作用后均抑制了这3种因子的分泌，分别为（52.692±11.368）pg/ml、（32.147±3.452）pg/ml、（20.123±2.173）pg/ml（P均＜ 0.05），与抗体芯片检测结果基本一致。

图2 抗体芯片检测有关细胞因子的表达

图3 各实验组有关细胞因子表达变化关系

表3 各实验组IL-19、IL-22、IL-23水平比较 （±s，n=3，pg/ml）

表3 各实验组IL-19、IL-22、IL-23水平比较 （±s，n=3，pg/ml）

注: a：与阴性组相比，P＞0.05；b：与TNF-α组相比，P＜0.05

组 别 IL-19 IL-22 IL-23阴性组 53.269±9.439 28.676±2.667 19.695±3.668 TNF-α组 88.800±16.064 a 49.994±5.214 a 25.584±1.987 a TNF-α+JWH133组 52.692±11.368 b 32.147±3.452 b 20.123±2.173 b F值 10.775 33.976 5.848 P值 ＜ 0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05

3 讨论

大麻素是一类具有多种药理活性的化合物，从结构和生物学上类似于植物大麻中提取出来的天然大麻素——四氢大麻醇（THC），这些化合物能够在各种类型的皮肤疾病中得到应用，比如寻常痤疮、各种皮炎、瘙痒症、银屑病等。大麻素化合物各种下游效应是通过大麻素受体介导，其中CB2R作为一种G蛋白偶联受体，主要表达于多种免疫细胞和组织，也表达于皮肤的角质形成细胞，参与细胞增殖、凋亡和免疫调节功能。JWH133是一种合成的CB2R激动剂，与其受体结合在细胞增殖、免疫调节方面能产生负性效应，由于该化合物具有特异性高且无成瘾的特点，近年来已广泛应用于抗肿瘤以及抑制炎症反应的研究[3]。在模拟治疗小鼠黑素瘤的实验中，在体内和体外激活CB2R均能抑制肿瘤的生长，这可能是通过抑制Akt的活化来促进视网膜母细胞瘤抑制蛋白（retinoblastoma protein，pRb）磷酸化，从而使细胞周期停滞于G1～S期[4]。Bettiga等[5]认为，CB2R激活后能够通过下调Akt表达，使其下游caspase3活化的机制诱导了膀胱癌细胞株的凋亡。本实验采用CCK-8法检测JWH133对HaCaT细胞体外增殖产生了抑制作用，体现了JWH133对HaCaT细胞抑制的时间和浓度依赖特性。流式细胞术检测结果表明，不同浓度JWH133均能诱导HaCaT细胞的凋亡。笔者推测，在检测细胞增殖、凋亡实验中Akt信号通路可能成为JWH133作用的一个共同靶点。

TNF-α是在炎症反应过程中扮演了多种信号通路激活的激发者，被认为是银屑病等炎症性疾病的发病机制中起到非常重要作用的细胞因子之一[6]。在本实验中，通过TNF-α处理体外培养的HaCaT细胞诱导类似银屑病角质形成细胞的炎症模型。抗体芯片检测技术具有高通量、高敏感度、平行性，能比较准确地反映蛋白质表达水平变化等特点，目前已成为定性和定量检测生物样品中蛋白质分子的重要检测手段之一[7]。抗体芯片检测结果显示，JWH133能不同程度抑制由TNF-α诱导的HaCaT细胞中IL-19、IL-22及IL-23的表达，且通过ELISA法验证了芯片检测结果的可靠性（P均＜0.05）。笔者推测JWH133可能通过CB2R/JNK及CB2R/STAT3信号通路直接或间接下调IL-23及IL-22的表达，而IL-23和IL-22的抑制又能减少IL-19的产生。IL-19是IL-10家族的细胞因子之一，IL-19能够在角质形成细胞、内皮细胞、巨噬细胞、B细胞中表达，通过与其受体复合物（IL-20Rα/IL-20Rβ）的结合导致下游STAT3的激活，可直接引起角质形成细胞的增殖和异常分化以及细胞因子的表达。另外，角质形成细胞产生的IL-19也能够上调CD8+T细胞产生角质形成细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）促进角质形成细胞的增殖[8]。IL-22也是IL-10家族成员之一，具有与IL-19相似的序列和结构的特征，IL-22能诱导角质形成细胞产生IL-19，在银屑病患者皮损处以及血清中发现IL-22过量表达，并且同样是激活下游的STAT3 形成银屑病的发病机制。全基因组关联分析研 究（genome-wide association studies，GWAS） 表明，即在银屑病有关细胞因子网络中，IL-22对银屑病皮损的作用通过IL-17和TNF-α的协同作用进一步增强。IL-23是由p19和p40组成异源二聚体细胞因子，能够激活JAK/STAT3信号通路增加IL-22的表达，在IL-23依赖性皮肤炎症和表皮增生模型中，IL-23能诱导小鼠皮肤IL-19表达，这3种因子之间相互联系，形成级联放大效应共同参与银屑病的发生发展[9,10]。Correa等[11]用N-花生四烯酸氨基乙醇（anandamide，AEA）能够通过JNK MAPK信号通路抑制LPS/IFN-γ诱导的人神经小胶质细胞株中IL-23的表达，这些作用部分由CB2R激活介导的。最新研究发现，GPCRs与STAT3之间可能形成一种信号级联参与肿瘤相关分子的转录调节[12]。另外，有大量相关文献记载，leptin、LIF、MCP-1、MIF、CD147这些炎性因子均能参与银屑病的病理过程[13-17]，本研究抗体芯片检测结果表明，在HaCaT细胞中能被TNF-α诱导表达增加的这些免疫分子可被JWH133不同程度地抑制。由此可见，银屑病不是单一某个因素作用的结果，而是一种免疫介导、多基因作用又相互联系的复杂性皮肤疾病。

综上所述，大麻素2型受体激动剂JWH133能抑制HaCaT细胞体外增殖，促进细胞凋亡，且在TNF-α诱导形成的银屑病炎症模型下能够抑制IL-19、IL-22及IL-23的 分 泌， 可 能 下 调leptin、LIF、MCP-1、MIF、CD147一些重要免疫分子的表达。本文对JWH133在HaCaT细胞中作用的研究处于一个初步探索的阶段，存在一定的局限性，但其今后能否成为治疗银屑病的药物尚需要进一步研究。