ICU肺炎克雷伯菌感染的分子流行病学调查

曹 莹 崔诗晗 崔天姝

（四平市中心医院，吉林 四平 136000）

1 资料与方法

1.1 一般资料：①实验菌株：2015年1月～2016年12月吉林某三甲医院ICU患者呼吸系统感染标本383份。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853菌株由北华大学基础医学院病原生物学实验室提供。②试剂：MH培养基：伊红美兰培养基、酵母提取物、胰蛋白胨、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTPs、乙酸钠、DNA Marker （1200 bp，2000 bp）蛋白酶K溴化乙锭聚乙二醇。③仪器：Gne AmpR PCR System 7200（Thermos Fisher，USA）；DY-WZ电泳仪（北京君意仪器厂）；UV WHITE-2020D凝胶成像分析系统（Biorad，USA）；TZK-900Z型紫外可见分光光度计（Dojin，Jap）；VITEK32型全自动细菌分析系统（法国生物－梅里埃公司）。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离鉴定：在无菌环境下挑取标本，接种于普通培养基37 ℃培养24 h，挑取单个菌落在37 ℃的环境下转种Maco平板培养基上，培养18～24 h，观察菌落特征，转种于双糖铁培养基上。用VITEK32型全自动细菌分析鉴定系统分离鉴定双糖铁上纯培养的细菌，用18%甘油肉汤保存肺炎克雷伯菌临床分离株，置-80 ℃冰柜冻存，备用。

1.2.2 K-B法检测肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药性：药敏判断结果依据美国临床实验室标准化协会（CLSI）2012标准判读结果，为敏感率（S）、中介率（I）、耐药率（R）[1]。

1.2.3 肺炎克雷伯菌临床分离株MIC的测定：结果判读按照临床实验室标准研究所（CLSI，2012）标准。

1.2.4 肺炎克雷伯菌临床分离株ESBLs表型确证。①肺炎克雷伯菌临床分离株ESBLs初筛试验：头孢曲松的抑菌环≤25 mm，头孢他啶抑菌环≤22 mm，头孢噻肟或者氨曲南的抑菌环≤27 mm的菌落为高度疑似ESBLs菌，需要进一步确认[2]。②肺炎克雷伯菌临床分离株ESBLs确认试验：用无菌棉拭子沾取菌液均匀涂布于整个MH琼脂平板表面，同时使用头孢他啶（30 μg）和头孢他啶/克拉维酸（30/10 μg）及头孢噻肟（30 μg）和头孢噻肟/克拉维酸（30/10 μg）两对药敏纸片，当两个药物中有任何一个在加克拉维酸后，抑菌环直径与不加克拉维酸的抑菌环相比增大值≥5mm，可确认为产ESBLs菌株。

1.2.5 肺炎克雷伯菌临床分离株ERIC-PCR的同源性分析。①肺炎克雷伯菌临床分离株DNA提取。②ERIC-PCR反应：ERIC-PCR引物序列见表1。

表1 ERIC-PCR引物序列

用1.5%的琼脂糖凝胶用DNA Marker作参照，以82 V电压进行电泳40 min。在紫外线反射仪的观察下，用凝胶成像分析系统观察和记录结果。

1.2.6 统计学方法：菌株耐药率之间的差异使用卡方检验。所有耐药标本数据采用PSS13.0统计软件进行分析，P＜0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺炎克雷伯菌临床分离株的鉴定与特征：2015年1月至2016年12，从吉林某三甲医院的ICU院内感染患者的383份呼吸系统标本中分离出103株肺炎克雷伯菌，生化反应菌均符合肺炎克雷伯菌[3]。初筛实验中61株菌高度疑似产ESBLs菌。确认实验中有46株肺炎克雷伯菌单独头孢类抑菌环的直径≥5 mm，同时加克拉维酸的抑菌环直径同时≥5 mm。

2.2 肺炎克雷伯菌临床分离株耐药性特征：在对抗菌药物的耐药性的比较中，其对头孢菌素类的耐药性有统计学意义（P=0.001，P＜0.01），对氨基糖苷类药品的耐药性没有明显区别（P=0.550＞0.05），对碳青霉烯类抗菌药物的敏感性很高（100%），在产ESBLs的肺炎克雷伯菌中其耐药性要低于普通单纯青霉素类。

2.3 肺炎克雷伯菌临床分离株MIC值：46株产ESBLs的肺炎克雷伯菌对氨苄西林、头孢曲松、头孢唑啉、氨曲南、头孢克肟及头孢他啶的MIC均＞256 µg/mL。阿米卡星、奈替米星、氨苄西林/舒巴坦及哌拉西林/他巴唑坦的MIC≥32 µg/mL。

2.4 肺炎克雷伯菌临床分离株ERIC-PCR同源性分析：PCR产物呈现8个条带，范围在100bp～2000bp的明显的主条带为6条，认为仅相差1～2个条带的视为基因型相似或密切相关；将相差2个条带以上的视为不同基因型。相似度高于80%时认为是该菌株在ICU院内主要流行，且为该种菌株较为重要的基因型。46株产ESBLs的肺炎克雷伯菌呈现为同一基因型（图1），证明同一克隆株在该院出现了小规模爆发流行。

3 讨 论

图1 产ESBLs 肺炎克雷伯菌ERIC-PCR琼脂糖凝胶电泳图谱

病原感染部位和耐药程度也在不断变化。及时掌握医院感染微生物的特点，对于有针对性的制定医院感染的管理和防治措施是非常重要的，尤其在ICU的住院患者的治疗中。然而抗菌药物的滥用导致机体产生多重耐药，感染“超级细菌”的风险在逐渐增大[3-4]。临床上由于大量高级头孢菌素类抗菌药物应用于ICU院内感染患者的治疗过程中，尤其是三代头孢的滥用及不合理使用，致使ICU患者病变部位的标本中产生了大量的耐药菌株，其中以产ESBLs的菌株为代表。目前针对高级头孢菌素或者β-内酰胺酶抑制剂治疗无效的患者，只能进一步采用碳青霉烯类抗菌药物来达到治疗G-杆菌的目的[5-6]。加强对医护人员的抗菌药物使用宣传教育，对药房，ICU住院环境进行加强管理，做到切实切断ESBLs细菌的传染源和传播途径，引导医护工作人员能够进一步进行循证医学，更加合理的应用抗菌药物[7-8]。

综上所述，归纳为几下3点：①某三甲医院ICU感染细菌的临床分布以呼吸系统最为常见。②非产ESBLs株的肺炎克雷伯菌对头孢菌素的敏感性远高于产ESBLs的肺炎克雷伯菌。产ESBLs肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物高度敏感。③产ESBLs肺炎克雷伯菌高度同源，为该院ICU内主要的院内耐药菌流行株。