肝郁证雌性大鼠乳腺组织癌前因子的表达及柴胡疏肝散的干预作用

钱梦， 谢鸣， 张媛凤， 刘碧原， 李聪

（北京中医药大学方剂学系，北京 100029）

基于此，本研究拟建立肝郁证雌鼠模型，观察该模型雌鼠乳腺组织的病理变化和癌前因子的表达及柴胡疏肝散的干预作用，为认识中医“肝郁”与女性乳腺病变关联的内涵（肝郁可能涉及女性乳腺癌前因子的异常表达）提供实验依据，并探讨柴胡疏肝散对防治肝郁证乳腺病的效用机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1动物健康性成熟未孕Wistar雌鼠55只，9周龄，级别SPF/VAF，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物质量合格证号：SCXK（京）2012-0001。于北京中医药大学动物房常规饲养，饲养条件：光照节律12L∶12D（6∶00～18∶00）；室温20～25℃；相对湿度（50±5）%。

1.2药物柴胡疏肝散组成（按21世纪课程教材《方剂学》第2版）：柴胡6 g、陈皮6 g、川芎5 g、香附5 g、枳壳5 g、芍药5 g、炙甘草3 g。以上药物由北京同仁堂药业股份有限公司提供，药材经北京中医药大学中药鉴定教研室刘春生教授鉴定均为正品。采用水提醇沉法将药物制成颗粒，每g颗粒含5 g生药。使用前用蒸馏水配制成12.4%和3.1%浓度的药液。

1.3试剂瑞士——姬姆萨复合染液（上海源叶生物科技有限公司，批号：R20659）；去甲肾上腺素（NE）酶联免疫吸附分析（ELISA）检测试剂盒（批号：20170520.60075R）、5-羟色胺（5-HT）ELISA检测试剂盒（批号：20170520.60087R）、多巴胺（DA）ELISA检测试剂盒（批号：20170520.60088R）；肾上腺素（E）ELISA检测试剂盒（批号：20170520.60082R）、基质金属蛋白酶抑制因子2（TIMP-2）ELISA检测试剂盒（批号：20170629.60045R）、生存素（Survivin）ELISA检测试剂盒（批号：20170629.60391R）、三叶因子1（TFF1）ELISA检测试剂盒（批号：20170629.60422R）、三叶因子3（TFF3）ELISA 检测试剂盒（批号：20170629.60423R）等均由北京瑞格博生物技术有限公司提供；促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）放射免疫测定试剂盒（批号：20161111）、皮质酮/肾上腺酮（CORT）放射免疫测定试剂盒（批号：20161116）、促肾上腺皮质激素（ACTH）放射免疫测定试剂盒（批号：20161118）等均由北京华英生物技术研究所提供。

1.4仪器自制束缚筒为有机玻璃制成的圆筒状结构，主筒长25 cm，筒口外径7 cm，内径5 cm；前端置有一直径小于主筒的、可以前后调节的带有透气孔的、便于大鼠头伸进的有机玻璃前罩，后端为可调节间距的开关阀门。Olympus-IX71光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron全自动生化分析仪（美国Beckmancoulter公司）；Thermo Multiskan MK7全自动酶标仪[Thermo（原芬兰雷勃）公司]。

1.5造模方法参考文献[4]采用慢性束缚应激的方法复制肝郁证大鼠模型：将大鼠放入有机玻璃束缚装置中，每天束缚3 h（AM 8∶00-11∶00），连续造模28 d。

提高课堂效率，教师的主导作用不能“矮化”。在实验中，我发现教师“教什么”比“怎么教”更为重要。许多教师不学习课程标准，不钻研教材，自己站位不高，所以对学生的引导也很肤浅。于是，我创立了中小学教师“说课标说教材”演讲活动，引导广大中小学教师“高站位把握课标，立体式驾驭教材”。

1.6分组处理健康雌性大鼠适应性喂养5 d后，进行为期5 d的雌鼠阴道涂片的制备，筛除动情周期不稳定的雌鼠。将合格的40只大鼠随机分为正常组（10只）和造模组（30只）。造模组雌鼠按上述方法造模14 d后，随机分为模型组、柴胡疏肝散大剂量组（简称“柴大组”）和柴胡疏肝散小剂量组（简称“柴小组”），每组10只。柴胡疏肝散大、小剂量均按成人用量（0.62 g/kg）的2倍、0.5倍量设定。柴大组、柴小组分别按1.24、0.31 g·kg-1·d-1给予中药汤液灌胃，每日1次，连续14 d。正常组及模型组给予等量蒸馏水。于造模第27天制备各组大鼠阴道涂片观察动情周期情况，选择动情前期/动情间期（实验第28～30天）处杀取材，测定各项指标。

1.7指标检测与方法

1.7.1 中医外观行为学指标 于实验进行的每周一和周五观测并记录各组大鼠的一般外观行为（行为状态、活跃程度、情绪反应、睡眠状态）的变化，并给予评分。外观行为的各项评分标准参考文献[5]。统计每周各组大鼠外观行为各项变化的积分，取每周2次观测的均值。最后将性质相近的外观表征合并为2个指标群（活动状态、情绪睡眠），并分别统计各指标群的积分。

1.7.2 乳腺病理观察 （1）制片操作步骤：①脱水，乳腺组织采用50%乙醇溶液→70%乙醇溶液→80%乙醇溶液→90%乙醇溶液→95%乙醇溶液Ⅰ、Ⅱ→无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各1.5 h梯度脱水；②透明，乳腺组织采用二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30 min；③浸蜡，乳腺组织浸蜡Ⅰ、Ⅱ各60 min；④包埋，将融化的石蜡导入包埋盒内，用加温镊子将浸蜡的乳腺组织迅速放入包埋盒，包埋温度为60～62℃，形成长方形石蜡块。（2）苏木素——伊红（HE）染色操作步骤：①石蜡切片置于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ各10 min；②无水乙醇Ⅰ、Ⅱ→95%乙醇溶液Ⅰ、Ⅱ→90%乙醇溶液→80%乙醇溶液→70%乙醇溶液，各5 min；③蒸馏水浸泡5 min；④苏木素染液浸泡15 min；⑤流动水冲洗5 min；⑥0.5%盐酸酒精分化30 s；⑦1%伊红染液浸泡10 min；⑧流动水冲洗1 min；⑨梯度酒精脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min；⑩中性树脂封胶片。（3）光镜观察：参考文献[6，7]对乳腺增生病理变化进行观察及描述。

1.7.3 ELISA法检测 采用ELISA法检测血浆5-HT、DA、E、NE，血清TFF1、TFF3及乳腺组织Survivin、TIMP-2含量，具体步骤按照各试剂盒说明书进行。

1.7.4 放射免疫法检测 采用放射免疫法检测血清ACTH、CORT及下丘脑CRH含量，具体步骤按照各试剂盒说明书进行。

1.8统计方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差(-x±s)表示。数据符合正态分布，组间比较采用单因素方差分析；非正态分布资料采用非参数统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。所有图表均用Graph Pad Prism 7软件制作。

2 结果

2.1柴胡疏肝散对雌性肝郁证大鼠中医证候的影响

2.1.1 各组大鼠一般外观行为学的变化 表1结果显示：与正常组比较，模型组大鼠第1～4周活动状态积分均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，柴大组第3、4周活动状态积分明显降低（P＜0.01），柴小组第3、4周活动状态积分有降低趋势（P＞0.05）。表2结果显示：与正常组比较，模型组大鼠第1周情绪睡眠评分未见明显变化（P＞0.05），第2～4周情绪睡眠评分均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，柴大组第3、4周情绪睡眠评分明显降低（P＜0.01），柴小组第3、4周情绪睡眠积分有降低趋势（P＞0.05）。

表1 各组大鼠不同时间点活动状态的积分变化比较Table 1 Comparison of the integral changes of activity status of rats in various groups at different time points （-x±s，s/分）

表2 各组大鼠不同时间点情绪睡眠的积分变化比较Table 2 Comparison of the integral changes of emotion and sleep in various groups at different time points （-x±s，s/分）

2.1.2 各组大鼠肝郁证候实验室指标的变化

2.1.2.1 单胺类递质的变化 表3结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血中5-HT、NE、DA含量明显降低（P＜0.05或P＜0.01），E含量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，柴大组大鼠血中5-HT、NE含量明显升高（P＜0.05或P＜0.01），柴小组大鼠血中NE、DA含量明显升高（P＜0.01）。

2.1.2.2 肾上腺皮质轴的变化 表4结果显示：与正常组比较，模型组大鼠下丘脑CRH、血清ACTH和CORT表达明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，柴大组大鼠下丘脑CRH、血清ACTH和CORT表达明显降低（P＜0.01），柴小组大鼠血清CORT表达降低（P＜0.05）。

表3 各组大鼠血浆单胺类递质的变化比较Table 3 Comparison of the changes of plasma monoamine transmitters in various groups (-x±s)

表4 各组大鼠肾上腺皮质轴的变化比较Table 4 Comparison of the changes of adrenalaxis indexes in various groups (-x±s)

2.2雌性肝郁证大鼠乳腺组织的变化及柴胡疏肝散的作用

2.2.1 各组大鼠乳腺病理的变化 图1结果显示：正常组大鼠乳腺腺泡形状规则，腺导管管腔无扩张，腺泡和导管内无分泌物（图1-a）；与正常组比较，模型组大鼠乳腺腺泡形状不规则，腺导管管腔扩张，导管内分泌物增加（图1-b）；与模型组比较，柴大组大鼠乳腺腺泡形状趋于规则，但仍伴有不规则腺泡，导管内分泌物减少（图1-c），柴小组大鼠乳腺腺泡趋于规则，但以不规则腺泡居多（图1-d）。

图1 各组大鼠乳腺病理的变化（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathomorphologic changes of mammary gland tissues in various groups（by HE staining，×200）

2.2.2 各组大鼠癌前因子的表达 表5结果显示：与正常组比较，模型组大鼠乳腺Survivin和TIMP-2含量明显升高（P＜0.01），血清TFF1、TFF3含量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，柴大组大鼠乳腺Survivin和TIMP-2含量均明显降低（P＜0.01），柴小组TIMP-2含量明显降低（P＜0.01）。

表5 各组大鼠癌前因子的表达比较Table 5 Comparison of the expression levels of precancerous factors in various groups (-x±s)

3 讨论

3.1肝郁证模型的复制肝郁证动物模型的建立目前主要有药物注射、慢性应激、情志刺激及复合造模等几种方法[8]，其中束缚法通过限制大鼠的活动，使其所欲活动不遂而发为肝郁，比较符合中医肝郁证的发病机制，是目前肝郁证动物模型建立的常用方法。对中医证候模型的判断方法包括中医证候表现、实验室指标及药物反证法[8]，而现阶段肝郁证模型的判断多采用证候标准[9-11]，主要包括模型动物在情绪、反应、食寐和大便等方面的改变，兼以单胺类递质和肾上腺皮质轴相关激素的变化作为佐证[12-14]。有研究采用慢性束缚应激法建立肝郁证大鼠模型3周[15]或4周[16]，观察到模型大鼠由最初情绪暴躁逐渐转为情绪低落，血浆ACTH和CORT含量明显增高，海马组织内5-HT、NA及DA均显著降低[17]。目前有关雌性肝郁证大鼠模型的研究不多，既往曾有将雌鼠用戊巴比妥麻醉后带枷联合单笼饲养法复制肝郁证模型，结果显示模型雌鼠表现出烦躁不安、易激惹转变为精神萎靡、倦卧少动[18]。另有用纱布束缚四肢并将雌鼠置于束缚筒内连续7 d[19]和采用慢性不可预知应激法21 d[20]建立肝郁证雌鼠模型的研究，结果显示模型雌鼠脑干DA、5-HT表达明显增加，血清NE含量升高。提示中医肝郁证存在中枢及外周单胺类递质的紊乱和肾上腺皮质轴功能的亢进。

本课题组既往采用慢性束缚应激法成功复制出雄性大鼠肝郁证模型[21]。本研究也观察到，雌鼠慢性束缚2周后开始出现多动、情绪不稳等表现，后逐渐转为神情抑郁、活动减弱、反应迟缓等类似中医肝郁证的表现，外观变化积分显著高于正常组。束缚4周的雌鼠血中5-HT、NE及DA明显降低，下丘脑CRH、血中ACTH、CORT及E明显升高。表明该法诱导的雌鼠也存在肾上腺皮质轴的功能亢进和单胺类递质及交感神经功能的紊乱，该模型具有较好的可重复性，且不受性别的影响。

3.2肝郁证雌性大鼠乳腺的病理变化乳腺增生是一种既非炎症又非肿瘤的病变，其因末端乳管和腺泡上皮的增生和脱落，乳管膨胀而发生临床疼痛，病理过程则以腺体小叶和乳腺导管末梢扩张、增生和囊性改变为主。研究发现，激素可以诱导出大鼠乳腺增生症，如给予大鼠雌二醇[22]或雌二醇+黄体酮[23]注射30 d，均可引起模型大鼠乳腺腺泡和导管大量增生、小叶内腺泡聚集并大小不等、腺泡腔扩大及导管扩张、导管腔内出现大量分泌物等改变。本研究给予大鼠束缚4周，结果显示大鼠不仅表现出中医肝郁证相关指标的变化，且乳腺组织出现腺泡形状不规则、腺导管管腔扩张、腺泡和导管内分泌物增加等变化，表明该肝郁证雌鼠伴有乳腺增生样改变。

3.3肝郁证雌性大鼠乳腺癌前因子的变化存活素（Survivin）是凋亡蛋白抑制因子家族的一员，与肿瘤的增殖、血管生成等有着密切的关系，在许多恶性肿瘤中表达上调[24]，属于促癌因子。临床研究发现，乳腺癌患者乳腺组织内Survivin的水平均明显高于乳腺纤维瘤患者[25]和正常乳腺组织[26]。应用甲基亚硝基脲诱导9周的乳腺癌大鼠模型乳腺组织内的Survivin水平明显高于正常组[27]。本研究观察到，束缚4周的模型雌鼠乳腺组织Survivin表达明显升高，提示该模型大鼠存在促癌因子的过度表达、乳腺增生样变存在过度增殖的潜在风险。

基质金属蛋白酶（MMP）家族成员主要通过破坏细胞外基质而促进肿瘤细胞的侵袭和转移，而基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）则可有效抑制基质金属蛋白酶的活性，前者属于促癌因子，后者属于抑癌因子，二者处于动态平衡状态，当其平衡状态被打破则会导致细胞基质过度降解，诱发肿瘤侵袭转移。临床研究发现，TIMP-2在包括乳腺癌[28]在内的多种恶性肿瘤[29-31]中呈高表达；实验研究亦显示，乳腺癌小鼠模型乳腺组织内TIMP-2的表达明显高于正常乳腺组织[32]。因此，国内外有学者[33]认为TIMP-2在肿瘤组织内的升高是对MMP家族成员高表达反馈的结果。本研究观察到束缚4周的模型雌鼠乳腺组织内TIMP-2明显升高，提示肝郁证模型雌鼠乳腺组织内可能存在抑癌反馈机制的激活。

近年来的研究表明，TFF1和TFF3为抑癌因子[34]，具有肿瘤抑制、胃肠道黏膜保护和修复等生物功能[35-37]；但TFF1和TFF3同时与血管生成、细胞迁移、增殖等作用相关，因此也有认为其具有促进肿瘤生长和转移的作用[38]。目前有关TFF1与TFF3对于癌肿的影响尚存在分歧。临床研究曾发现，乳腺癌患者血清TFF1[39]和TFF3表达较健康对照组明显升高，56.5%的乳腺癌患者TFF1表达阳性，73.9%的乳腺癌患者TFF3表达阳性[40]。而在胃癌与TFF1的关系研究中表明，TFF1在正常胃黏膜中表达最高，在上皮不典型增生至胃癌发展中逐渐下降[41]，因此有学者认为TFF1的表达降低是胃癌发展过程中的早期事件[42]，提示TFF1表达降低可能与早期癌变存在联系。本研究观察到，束缚4周的模型雌鼠血清TFF1和TFF3表达较正常组降低。但其与该模型乳腺增生之间是否存在关联尚不清楚，有待进一步研究。

3.4柴胡疏肝散对模型大鼠肝郁证的影响本研究观察了肝郁证的因证治方——柴胡疏肝散对该模型下雌鼠肝郁证候的影响。结果显示，柴胡疏肝散大剂量可使模型大鼠的活动状态、情绪睡眠等外观表征积分降低，小剂量对积分有降低趋势。柴胡疏肝散大剂量可显著降低模型雌鼠下丘脑高表达的CRH、血中高表达的ACTH和CORT水平，明显升高血中降低的5-HT和NE水平，对血中的E及DA也有一定的反转趋势；小剂量可显著降低模型雌鼠血中升高的CORT、升高其血中降低的NE及DA，对CRH、ACTH、5-HT和E的紊乱无明显的调节作用。表明柴胡舒肝散有改善肝郁证模型大鼠的外观表征和相关实验室指标的作用，大剂量作用优于小剂量。

3.5柴胡疏肝散对模型大鼠乳腺及其癌前因子的作用本研究结果显示，模型大鼠给予大、小剂量柴胡疏肝散2周后，模型雌鼠乳腺组织腺泡形状趋于正常、腺泡及导管内分泌物减少。表明柴胡疏肝散具有减轻肝郁证模型大鼠乳腺增生样变的作用，其中大剂量疗效优于小剂量。本研究还观察到，柴胡疏肝散可使模型大鼠乳腺内升高的存活素和TIMP-2明显降低，血清TFF1和TFF3呈现升高趋势，提示其有下调模型雌鼠乳腺促癌因子的表达、抑制乳腺增生样变进一步发展为过度增殖、促进抑癌因子的表达、激活抑癌反馈机制而具有潜在防癌作用。

综上所述，慢性束缚法复制的肝郁证模型雌性大鼠呈现中医证候相关的外观行为和实验室指标的改变，并伴有乳腺增生样变，乳腺组织伴有相关癌前因子表达的异常，提示肝郁证乳腺增生可能存在癌前病变的分子机制。柴胡疏肝散不仅对肝郁证雌性大鼠的中医证候和实验室指标具有较好的改善作用，而且对模型大鼠的乳腺增生也有一定的抑制作用，其在缓减模型大鼠乳腺增生的同时，还可调节模型大鼠乳腺促癌/抑癌因子的表达。

本研究对于丰富“肝郁”与女性乳腺增生及癌前病变相关提供了一定的病理生理学及分子层面上的理解，为认识柴胡疏肝散可能具有潜在的防癌效用提供了一定的药理学依据。