莲藕多酚-多糖复合脂质体的制备及稳定性评价

王诗琪,钟照恬,易 阳,*,闵 婷,王丽梅

(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023; 2.武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉 430023)

莲藕是我国种植面积最大、产量最高的水生蔬菜,富含碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质等,且据古医书记载连藕具有清热止血、调节内分泌、滋阴安神等功效[1-2]。据现代药理学研究可知,莲藕及其提取物具有免疫调节、降血脂、降血压、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抑菌等作用,而多酚和多糖是其主要的功能因子[3-6]。但是,关于莲藕功能性产品的研究开发鲜见报道。

目前,关于植物功能性成分的提取开发主要包括:提取制备浓缩液、提取干制为粉剂、制成(复合)片剂或脂质体等。大量研究报道了莲藕多酚和多糖的提取工艺[7-8],但极少涉及相关提取物的产品制备。脂质体作为一种生物降解性和生物相容性功能性成分载体,具备一定的靶向性和缓释性,具有减少功能性成分用量、提高利用率、增强功能成分稳定性等优点,近年来受到广泛的关注[9-11]。马宁等[12]采用乙醇注入-超声法制备茶多酚脂质体,提高茶多酚的稳定性和生物利用率,从而拓展其在食品及工业中的应用;Wu等[13]采用逆向蒸发法制备甘草多糖脂质体,增强了甘草多糖的免疫活性;而Fan等[14]制备淫羊藿多糖和蜂胶黄酮的复合脂质体,该脂质体相比于单一脂质体更稳定,且起到了协同增效的作用。当前,对莲藕多糖和多酚的研究主要集中在提取、分离纯化、结构/组成分析以及活性评价等方面[3-8],关于脂质体的开发尚未见报道。

本文分离纯化莲藕中多糖和多酚,采用逆向蒸发法制备其复合脂质体,以多糖和多酚的包封率为指标,结合单因素试验和正交试验优化其配方与工艺,然后进一步考察脂质体在不同贮藏形式和条件下的稳定性,以期为莲藕功能成分的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜莲藕 武汉市金水祺良农副产品有限公司,鄂莲5号;大豆卵磷脂 上海源叶生物科技有限公司,纯度>90%;胆固醇 上海源叶生物科技有限公司,纯度>95%;Triton X-100、没食子酸和Folin-Ciocalteu试剂 分析纯，国药集团化学试剂有限公司;HPD-100大孔树脂 上海摩速科学器材有限公司,分析纯;HiPrepSephacryl S-100凝胶 美国GE Healthcare公司。

XHF-D型高速分散器 宁波新芝科技股份有限公司;UV-1800型紫外-可见分光光度计 日本岛津有限公司;RE-200A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;Nano-ZS90 型纳米粒度和Zeta电位仪 英国马尔文仪器有限公司;SB-5200型超声清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 莲藕多酚和多糖的分离纯化 参考徐燕燕[15]的方法提取莲藕多酚,取新鲜莲藕切碎至莲藕渣,按料液比为1∶20 (g/mL)加入40%浓度乙醇,采用匀浆机以10000 r/min转速处理5 min。匀浆由乙酸调节至pH3,置于200 W超声场中持续浸提72 min,经4500 r/min离心10 min分离上清液。过滤上清液后得到多酚粗提液,60 ℃真空浓缩后,放置于-20 ℃冰柜保存。采用HPD-100型大孔树脂静态吸附纯化多酚,得到多酚纯度为58.21%,主要由没食子儿茶素、表没食子儿茶素和儿茶素组成。

参考王瑜[16]的方法提取莲藕多糖,取新鲜莲藕切碎至莲藕渣再称取100 g加入1.5 L蒸馏水,采用高速匀浆机以8000 r/min转速均质处理5 min,置于90 ℃热水浴中浸提2 h。浸提结束后4500 r/min离心10 min分离上清液。并将上清液过滤后于65 ℃真空浓缩约至200 mL。浓缩液加入无水乙醇调节乙醇体积浓度至30%或40%,于4 ℃静置6 h后离心(4500 r/min,10 min)除去沉淀,调节乙醇体积浓度至80%继续静置6 h沉淀无淀粉多糖。离心分离沉淀,采用80%乙醇洗涤后蒸发乙醇,用适量蒸馏水溶解并冷冻干燥得到莲藕粗多糖。提取的多糖采用HiPrepSephacryl S-100凝胶过滤层析纯化,得到多糖纯度为51.31%,其结构为[α-D-Glc(1-4)-]n型葡聚糖。

1.2.2 莲藕多酚-多糖复合脂质体的制备工艺 参考李唐棣[25]的方法并略做修改,采用逆向蒸发法制备脂质体。取一定量的磷脂与胆固醇作为膜材,以10 mL含有一定量莲藕多酚的40%乙醇溶液溶解膜材,与30 mL含有一定量莲藕多糖的磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L,pH=7.4)混合,40 kHz,300 W下超声处理一定时间;于55 ℃真空旋转浓缩,直至圆底烧瓶上形成均匀胶状薄膜;加入磷酸盐缓冲液旋转使凝胶脱落,用高速分散器在一定转速下剪切处理为均匀的脂质体混悬液。另在同样的条件下制备不含莲藕多酚和多糖的空白脂质体。

1.2.3 莲藕多酚-多糖复合脂质体制备的单因素实验 取多酚质量浓度15 mg/mL多糖质量浓度1.5 mg/mL、磷脂-胆固醇质量比4∶1、超声处理时间6 min、高速剪切转速8000 r/min为复合脂质体制备的基本工艺参数,分别变换多酚质量浓度5、10、15、20和25 mg/mL;多糖质量浓度1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg/mL;磷脂-胆固醇质量比1∶10、1∶8、1∶6、1∶4和1∶2;超声处理时间3、6、9、12和15 min;高速剪切转速4000、6000、8000、10000和12000 r/min,考察以上因素对莲藕多酚-多糖复合脂质体包封率的影响。

1.2.4 正交试验 在单因素实验的基础上,确定影响脂质体的包封率的主要因素为多酚质量浓度、多糖质量浓度及磷脂-胆固醇质量比,根据单因素实验结果,固定超声时间为6 min、高速剪切转速为8000 r/min,设计L9(43)正交试验优化莲藕多酚-多糖复合脂质体制备的配方,因素及水平如表1所示。

表1 正交试验因素及其水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 莲藕多酚-多糖复合脂质体的试样制备及稳定性评价 按优化配方和工艺参数制备莲藕多酚-多糖复合脂质体,采用磷酸盐缓冲液定容至原体积的1/4。取2.5 mL脂质体悬浊液至西林瓶中,经-20 ℃预冻 24 h后于-55 ℃冷冻干燥36 h得冻干脂质体复合物,密封保存用于稳定性评价。

将脂质体悬浊液分装于9组西林瓶中,每组3瓶,每瓶2.5 mL。其中1组用于分析脂质体初始特征(多酚包封率、多糖包封率、Zeta电位和粒径分布),另8组分别置于4 ℃和25 ℃条件下保存24、48、72和96 h后进行分析[17]。

取9组含冻干脂质体粉末的西林瓶(每组3瓶),其中1组每瓶加入2.5 mL磷酸盐缓冲液重建后分析冻干脂质体初始特征,另8组分别置于4 ℃和25 ℃条件下保存5、10、15和20 d后进行脂质体重建与分析[17]。

1.2.6 分析方法

1.2.6.1 多酚和多糖包封率的测定 采用Folin-Ciocalteu法测定多酚质量浓度[18],结果以没食子酸当量表示。参考王文等[19]的方法,采用苯酚硫酸法检测多糖含量,结果以葡萄糖当量表示。基于脂质体游离多酚(游离多糖)和总多酚(总多糖)的质量浓度按如下公式计算复合脂质体的包封率(EE):

包封率(EE,%)=(Ct- Cf)/Ct×100

式中:Ct为总酚(总多糖)浓度,mg/mL;Cf为游离多酚(多糖)浓度,mg/mL;EE为包封率,%。

1.2.6.2 粒径和Zeta电位分布测定 取复合脂质体样品稀释适当的倍数,加入样品池中,用Nano-ZS90 型纳米粒度和Zeta电位仪测定其粒径分布和Zeta电位[20]。

1.3 数据处理

实验数据均以 “平均值±标准偏差”表示(n=3)。采用SPSS 19.0软件S-N-K检验分析组间数据显著性差异(0.05水平)。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 多酚质量浓度对脂质体包封效果的影响 由图1可知,随着莲藕多酚质量浓度的增加,脂质体的多酚包封率先增后减,各组间差异显著(P<0.05),在多酚质量浓度15 mg/mL时获得最大多酚包封率70.27%,此时多酚的包封可能达到饱和。而多糖包封率则随莲藕多酚质量浓度的增加显著降低(P<0.05),直至多酚质量浓度超过15 mg/mL后趋于稳定(P>0.05),这一结果与旷英姿的研究相似[21]。为了获得相对高的多酚包封率,选择莲藕多酚添加质量浓度为10～20 mg/mL。

图1 莲藕多酚质量浓度对脂质体包封效果的影响Fig.1 Effect of lotus root polyphenol content on the encapsulation efficiency of liposomes

2.1.2 多糖质量浓度对脂质体包封效果的影响 由图2可知,当多糖质量浓度由1.0 mg/mL增加至1.5 mg/mL,多糖包封率和多酚包封率均未发生显著变化(P>0.05),但随后呈现截然不同的变化趋势:多糖包封率显著增加(P<0.05),继而维持稳定(P>0.05),这一现象与赵永新的研究结果基本一致[22];多酚包封率显著下降(P<0.05),后在多糖质量浓度2.0～2.5 mg/mL之间维持稳定水平(P>0.05),而在多糖质量浓度3.0 mg/mL时，多酚包封率最低(25.10%),这可能与多糖与多酚的非共价相互作用机制有关[23],多酚与多糖通过非共价作用形成聚合物增大了颗粒直径,导致多酚的包封率下降。为了获得相对较高的多糖包封率,选择莲藕多糖添加质量浓度为1.5 mg/mL。

图2 莲藕多糖质量浓度对脂质体包封效果的影响Fig.2 Effect of lotus root polysaccharide content on the encapsulation efficiency of liposomes

2.1.3 磷脂-胆固醇质量比对脂质体包封效果的影响 磷脂-胆固醇质量比对脂质体包封效果的影响如图3所示。莲藕多糖和多酚的包封率均呈先上升后下降的趋势,且二者均在磷脂-胆固醇质量比为1∶4时达最大值(P<0.05),分别为15.12%和77.61%。在茶多酚脂质体制备的研究中优化的最佳配方中磷脂-胆固醇比为3∶1[24],而本实验中添加了大量多糖成分,增强了其水溶性,则需要提高胆固醇的量以提高包封率[25]。胆固醇是脂质体类脂膜的重要组成部分,添加适量的胆固醇可以增加脂质双分子膜中脂质分子排列的紧密程度,调节磷脂分子膜的流动性,有助于减轻加热时脂质分子烃基的弯曲程度,从而起到稳定脂膜和减少渗漏作用。但胆固醇增加过多可能增加脂质双分子膜不对称性,因而更易导致膜的不稳定,使包封内容物渗漏[26-27],为获得较高的脂质体包封率,选择磷脂-胆固醇质量比为1∶4。

图3 磷脂-胆固醇质量比对脂质体包封效果的影响Fig.3 Effect of phospholipid-cholesterol mass ratio on the encapsulation efficiency of liposomes

2.1.4 超声处理时间对脂质体包封效果的影响 由图4可见,随着超声处理时间的延长,莲藕多糖和多酚的包封率均呈先升后降的趋势,且二者均在超声处理6 min时达到最大包封率(P<0.05),分别为14.83%和70.12%。随着超声时间的延长,复合脂质体的粒径和分散系数可以不同程度地减小,有助于提高包封率,但超声时间过长时,脂质体磷的双分子层被破坏,导致脂质体破裂[28]。故而,超声处理时间以6 min为宜。

图4 超声处理时间对脂质体包封效果的影响Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the encapsulation efficiency of liposomes

2.1.5 高速剪切转速对脂质体包封效果的影响 由图5可知,莲藕多糖和多酚的包封率均随着高速剪切转速的增加先增后减,二者均在8000 r/min时获得最大包封率(P<0.05),分别为16.24%和77.09%。增加剪切转速有助于形成状态稳定、大小较均一的脂质体混悬液,但是转速过大容易引起复合脂质体膜破裂,包封内容物泄漏[26-27]。故脂质体混悬液高速剪切转速选择8000 r/min为宜。

图5 高速剪切转速对脂质体包封效果的影响Fig.5 Effect of rotational speed on the encapsulation efficiency of liposomes

2.2 莲藕多酚-多糖复合脂质体的配方优化

通过正交设计确定复合脂质体配方。在前期实验基础上确定了影响复合脂质体包封率的主要因素:莲藕多酚质量浓度、莲藕多糖质量浓度和磷脂-胆固醇质量比。因此设计L9(43)正交试验,结果见表2。

表2 复合脂质体配方优化正交试验设计与结果Table 2 The orthogonal experiment design and results of formulation optimization for the liposome complex

由表2极差分析和表3方差分析可知,各因素对莲藕多酚包封率和多糖包封率的影响均依次为:磷脂-胆固醇质量比(C)>多酚质量浓度(A)>多糖质量浓度(B),仅磷脂-胆固醇质量比(C)及多酚质量浓度(A)对莲藕多酚包封率有显著影响(P<0.05)。包封莲藕多酚的最优组为A2B2C2,包封莲藕多糖的最优组为A2B3C2,因为多糖质量浓度对多酚和多糖包封率均无显著影响(P>0.05),为减少多糖添加量,确定复合脂质体制备的最优配方为A2B2C2即:莲藕多酚质量浓度15 mg/mL,莲藕多糖质量浓度1.5 mg/mL,磷脂-胆固醇质量比1∶4。进一步验证发现,在该条件下所得脂质体的多酚包封率为72.36%±2.83%,多糖包封率为15.66%±1.01%,电位为-(38.70±0.39) mV,粒径为(123.01±0.97) nm。

表3 方差分析结果Table 3 Results of variance analysis

2.3 莲藕多酚-多糖复合脂质体的稳定性

2.3.1 贮藏过程中脂质体的多酚和多糖包封率变化 包封率是判断脂质体稳定性的主要指标之一,随着贮藏时间的增加,4和25 ℃贮藏液态复合脂质体和冻干脂质体的多酚包封率在不同阶段均发生显著下降(P<0.05)。如图6(Ⅰ)所示,在4 ℃贮藏96 h后液态脂质体多酚包封率由72.36%降至49.28%,而25 ℃下则降至25.09%,包封率降幅分别为23.08%和47.27%;如图6(Ⅱ)所示,冻干脂质体在4 ℃贮藏20 d后多酚包封率由72.66%降至65.13%,而25 ℃下则降至57.66%,包封率降幅分别为7.53%和15.00%。两种脂质体在相同贮藏时间下(贮藏24 h后),4 ℃的多酚包封率均显著高于25 ℃,说明低温有利于脂质体的贮藏,与杨培民[20]中使用的低温贮藏的方式制备的白花蛇舌草黄酮苷元脂质体的稳定性高于高温实验下的脂质体这一研究结果一致。同时,相比于液态脂质体,冻干脂质体在相同条件下储藏相同时间其多酚包封率下降幅度明显减小,说明冻干脂质体更有利于长期储藏,这可能与冻干脂质体水分少,易氧化成分更加稳定有关[29]。

图6 莲藕多酚-多糖复合脂质体贮藏过程中的多酚包封率变化Fig.6 Changes of encapsulation efficiency of polyphenols during storage of lotus root polyphenol-polysaccharide complex liposomes注:图Ⅰ为液态脂质体,图Ⅱ为冻干脂质体; 不同小写字母表示在4 ℃温度下,不同贮藏时间 脂质体的多酚包封率的差异显著P<0.05;不同大写 字母表示在25 ℃温度下,不同贮藏时间脂质体的 多酚包封率的差异显著P<0.05;图7～图9同。

不同贮藏温度下,时间对液态复合脂质体多糖包封率和冻干脂质体多糖包封率的影响,如图7所示。随着贮藏时间的延长,4 ℃和25 ℃贮藏液态复合脂质体和冻干脂质体的多糖包封率在不同阶段均显著下降(P<0.05),如图7(Ⅰ)所示。4 ℃贮藏96 h后多糖包封率由15.67%降至6.81%,而25 ℃下则降至6.23%,包封率降幅分别为8.86%和9.44%;冻干脂质体在4 ℃贮藏20 d后多糖包封率由15.55%降至11%,而25 ℃下则降至9.45%,包封率降幅分别为4.55%和6.1%。两种脂质体在相同贮藏时间下(贮藏24 h后),4 ℃的多糖包封率均高于25 ℃,说明低温有利于脂质体的贮藏,高金芝等[30]将人参皂苷Re冻干脂质体置于4 ℃下贮藏10 d,发现各指标无明显变化,而40 ℃及60 ℃下各指标稳定性较差。同时,相比于液态脂质体,冻干脂质体在相同条件下储藏相同时间其多糖包封率下降幅度明显减小,这一现象与Strauss[31]的研究相符。

图7 莲藕多酚-多糖复合脂质体贮藏过程中的多糖包封率变化Fig.7 Changes of polysaccharide encapsulation rate of lotus root polyphenol-polysaccharide complex liposomes during storage

2.3.2 贮藏过程中脂质体的电位变化 脂质体在溶液中的运动与荷电胶体粒子相似,通过改变组分的荷电性质和荷电量及介质的离子强度,可以使电位保持在足够高的水平,并减少颗粒相互间的聚沉和融合,增加稳定性[22]。随着贮藏时间的延长,4 ℃和25 ℃贮藏液态复合脂质体电位和冻干脂质体电位的绝对值在不同阶段均显著下降(P<0.05),如图8所示。液态脂质体在4 ℃贮藏96 h后复合脂质体电位的绝对值由38.70降至26.97,而25 ℃下则降至25.40,复合脂质体电位的绝对值降幅分别为11.73和13.30;冻干脂质体在4 ℃贮藏20 d后复合脂质体电位的绝对值由38.70降至35.80,而25 ℃下则降至28.97,复合脂质体电位的绝对值降幅分别为2.90和9.73。相同贮藏时间下(贮藏24 h后),4 ℃的复合脂质体电位的绝对值显著均高于25 ℃,说明低温有利于脂质体的贮藏。同时,相比于液态脂质体,冻干脂质体在相同条件下储藏相同时间其脂质体电位下降幅度明显减小。

图8 莲藕多酚-多糖复合脂质体贮藏过程中脂质体的电位变化Fig.8 Changes of potential of lotus root polyphenol- polysaccharide complex liposome during storage

2.3.3 贮藏过程中脂质体的粒径变化 脂质体的大小直接影响包埋物质的载量、释放、利用率以及生物体内分布和靶向性,控制粒子的大小和获得较窄且均匀的粒度分布是制备纳米制剂的关键[25]。随着贮藏时间的增加,4 ℃和25 ℃贮藏液态复合脂质体的粒径与冻干脂质体的粒径在不同阶段均发生显著增加(P<0.05),如图9所示。液态脂质体在4 ℃贮藏96 h后复合脂质体的粒径由123.10 nm增加至151.17 nm,而25 ℃下则增至157.63 nm,复合脂质体的粒径增加了22.80%和28.05%;冻干脂质体在4 ℃贮藏20 d后复合脂质体的粒径由123.10 nm增加至128.47 nm,而25 ℃下则增至135.37 nm,复合脂质体的粒径增加了4.36%和9.97%相同贮藏时间下(贮藏24 h后)。4 ℃的复合脂质体的粒径均小于25 ℃。实验结果表明脂质体储藏时会随着时间的延长造成凝聚沉淀,而在冷藏条件下可延缓此变化,与参考文献中低温贮藏可以减缓白花蛇舌草脂质体复合物的粒子沉降速度这一研究结果一致[20]。同时,相比于液态脂质体,冻干脂质体在相同条件下储藏相同时间其脂质体粒径增大幅度明显减小,这一结果与Cavalli R的研究相符合[32]。

图9 莲藕多酚-多糖复合脂质体贮藏过程中脂质体的粒径变化Fig.9 Changes of particle size of lotus root polyphenol- polysaccharide complex liposome during storage

3 结论

采用逆向蒸发法制备莲藕多糖-多酚复合脂质体,得出莲藕多糖-多酚复合脂质体最佳制备工艺为:磷脂-胆固醇质量比为1∶4、莲藕多酚质量浓度为15 mg/mL、莲藕多糖质量浓度为1.5 mg/mL、超声时间6 min、高速剪切转速为8000 r/min。在该工艺条件下所得脂质体的电位为-38.70 mV、粒径为123.01 nm、莲藕多酚包封率为72.36%、多糖包封率为15.66%。同时考察不同贮藏条件对莲藕多糖-多酚复合脂质体稳定性的影响,结果发现冻干脂质体的稳定性明显优于液态脂质4 ℃,而低温(4 ℃)有利于脂质体保存。在4 ℃下,冻干脂质体贮藏20 d与液体脂质体放置24 h的包封率相近,莲藕多酚包封率约65%、多糖包封率约11%,综上所述,相比单一脂质体,冻干的莲藕多酚-多糖复合脂质体具有更高的稳定性和生物利用率,该实验结果为莲藕功能产品的进一步开发提供了一定的参考。