高效液相色谱-碰撞/反应池-电感耦合等离子体质谱测定贝类中砷形态化合物及健康风险评估

王志鹏,薛长湖,2,*,徐 杰,李兆杰

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003; 2.青岛市海洋科学技术国家实验室,山东青岛 266003)

贝类,属软体动物门中的双壳纲或瓣鳃纲,常见的贻贝、牡蛎、蛏、蛤等都属此类,现存贝类的种类1.1万种左右。海洋贝类由于味道鲜美,并且含有丰富的蛋白质,低脂肪且脂肪多为不饱和脂肪酸(ω-3和ω-6),富含多种人体必需矿物质、维生素,深受沿海居民的喜爱[1]。近年来,随着人们环保意识的不断增强以及对食品安全关注的与日俱增,贝类的食用安全性评价,尤其是会对人体健康产生重要影响的有毒有害元素残留问题,备受国内外学者的关注[2]。

砷,一种具有准金属特性的非金属元素,具有与其他重金属元素类似的毒性。研究发现,砷元素的毒性不仅与其总含量相关,而且很大程度上取决于砷元素的形态[3]。水产品中砷可以分为无机砷(三价砷As(Ⅲ)、五价砷As(V))和有机砷(一甲基砷MMA、二甲基砷DMA、砷甜菜碱AsB、砷胆碱AsC等)两大类。无机砷是砷元素化合物致癌、致畸的主要来源,有机砷通常被认为是低毒性或者无毒性的,以半致死量(lethal dose 50,LD50)计,毒性按大到小依次为As(Ⅲ)>As(V)>MMA>DMA>AsB>AsC[4-5]。因此,建立有效提取和准确测定砷形态化合物的方法对于水产品中砷元素食用安全性评价具有重要意义。

目前元素As的检测方法有:原子吸收光谱法(Atomic Absorption Spectroscopy,AAS),该方法具有操作简单、维护成本低等优点,但不能同时测定多种元素[6];原子荧光光谱法(Atomic Fluorescence Spectrometry,AFS),该方法干扰较小、谱线简单,但能分析的元素种类有限[7];电感耦合等离子体原子发射光谱法(Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer,ICP-OES),该方法线性范围宽、灵敏度较高,并且能实现多元素的同时测定,但在测定过程中光谱干扰对测定结果影响较大[8];电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS),对比前三种方法,该方法在分析灵敏、准确性、抗干扰能力方面均具有优势[9]。在海产品砷元素的测定过程中,样品中含有高浓度的氯元素和其他元素,会产生严重的多原子离子干扰问题[10]。随着现代科学技术的高速发展,配备八极杆碰撞反应池系统(Octopole Reaction System,ORS)的ICP-MS通过在碰撞/反应池(CRC)中通入气体(He、O2或其他气体),与离子束中离子进行碰撞或反应来消除Ar气、空气、水、试剂及其他复杂基体如双电荷离子所产生的各种类型的质谱干扰[11],是解决四极杆ICP-MS(ICP-QMS)质谱干扰问题的一个重大技术突破,并且迅速发展为目前ICP-MS最有效的质谱干扰消除技术。

本研究以青岛市售贝类样品为研究对象,微波消解后采用基于碰撞/反应池技术的ICP-MS法测定其中砷元素含量,分析在不同贝类中砷元素的分布情况,并且通过HPLC-ICP-MS对其中砷元素形态进一步探究,依据国家对砷元素的限量标准,结合当地贝类消费量,并与美国环境保护局(USEPA)推荐的健康风险模型和健康风险,对贝类的污染状况和食用安全性进行科学评估。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牡蛎、蛤蜊、毛蚶、扇贝、缢蛏、竹蛏、青口贝、北极贝、夏威夷贝共9种 青岛南山水产市场和团岛水产市场;1 μg/L(Li、Mg、Y、Ce、Tl、Co)调谐溶液、100 μg/mL(Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh、Sc、Tb)内标溶液、10 μg/mL砷元素标准溶液 美国Agilent公司;砷形态物质标准溶液:AsC((28.0±1.1) μg/g)、AsB((38.8±1.1) μg/g)、MMA((25.1±0.8) μg/g)、DMA((25.1±0.8) μg/g)、As(V)((17.5±0.4) μg/g)、As(Ⅲ)((75.7±1.2) μg/g) 国家标准物质中心;65%硝酸(色谱纯) 默克公司;碳酸铵(色谱纯) 阿拉丁公司;标准参考物质SRM 1566b(总砷含量:((7.65±0.65) mg/kg) 美国国家标准与物质研究所;所用玻璃器皿及聚四氟乙烯消解罐内罐 均需以20%的硝酸溶液浸泡24 h以上,再用超纯水漂洗3次,最后储存在密封的塑料容器中防止再次污染。

1260 HPLC高效液相色谱仪 美国Agilent公司;8800 ICP-MS电感耦合等离子体质谱(配有Micromist标准雾化器、Scott双通道雾化室、在线内标添加组件包、Ni接口锥、双四极杆、CRC池和MassHunter数据处理软件) 美国Agilent公司;Hamilton PRP-X100阴离子色谱柱(250 mm×4.1 mm,10 μm) 瑞士Hamilton公司;XT-mul新拓微波消解仪(配有消解罐) 上海新拓仪器公司;LPHA 1-4 LD plus冷冻干燥机 德国Christ公司;Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司;AX124ZH分析电子天平 常州奥豪斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 砷元素标准工作液:将砷元素标准储备液进行逐级稀释,配制成浓度分别为0.0、0.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L;砷形态标准工作液:取六种砷形态化合物标准溶液进行逐级稀释,配制成浓度分别为0.0、0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100.0 μg/L。

1.2.2 样品前处理

1.2.2.1 总砷测定前处理 贝类去壳,取用超纯水漂洗三次去除外来杂质,研磨混匀,取样0.5 g(精确到0.0001 g)于微波消解罐中,加入5 mL浓硝酸,冷消化30 min后,将消解罐放入微波消解系统中,升温功率1200 W,升温时间5 min,运行温度120 ℃;在3 min内升至180 ℃,功率1800 W,保持15 min[12]。微波消解完毕后,待消解液冷却后,将消解液转移至50 mL容量瓶中,用少量超纯水洗涤内罐3次,合并洗涤液并定容至刻度,混匀后过0.45 μm滤膜上ICP-MS分析总砷含量。同时做空白对照实验。

1.2.2.2 砷形态测定前处理 准确称量均质后的贝类样品0.3 g(精确到0.0001 g)于50 mL离心管中,加入20 mL 0.15 mol/L的硝酸溶液,3000 r/min涡旋1 min,使提取溶液与样品充分混合。80 ℃加热30 min,然后超声(200 W)水浴5 min,重复上述步骤5次。提取完毕后,取出冷却至室温,8000 r/min离心10 min,取上层清液于50 mL容量瓶中,并定容至刻度,混匀后过0.45 μm滤膜后上HPLC-ICP-MS分析砷形态化合物含量。同时做空白对照实验。

1.2.3 色谱条件的优化 使用Hamilton PRP-X100阴离子色谱柱优化流动相组成,选择碳酸铵-水体系作为流动相,通过控制单一因子变量来探究流动相离子浓度和pH对色谱峰形的影响。在流动相pH=9.5的条件下,碳酸铵浓度分别为30、40、50、60 mmol/L对六种砷形态化合物色谱分离的影响;在碳酸铵浓度为50 mmol/L的条件下,流动相pH分别为9.0、9.3、9.5、9.8对六种砷形态物质色谱分离的影响。

1.2.4 仪器条件 HPLC工作参数:Hamilton PRP-X100阴离子色谱柱(250 mm×4.1 mm,10 μm);流动相A:水,流动相B:50 mmol/L碳酸铵溶液(pH=9.5);梯度洗脱:0～3 min,100% A,3～4 min,0%～100% B,4～12 min,100% B;流速1.0 mL/min,柱温25 ℃。

ICP-MS工作参数:分析模式为全定量分析,射频功率1550 W,等离子气流速15.0 L/min,辅助气流速1 L/min,载气流速1.05 L/min,补偿气流速0.35 L/min,蠕动泵转速0.3 r/s,采样深度10.1 mm,数据重复采集3次,积分时间为0.1 s,扫描类型为单杆/串接,采用ICP-MS中的No gas模式、He模式、O2三种模式依次测定标准溶液。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 标准工作曲线的绘制 在上述最佳仪器条件下,将砷元素标准溶液按照浓度从低到高依次在ICP-MS中进样,测定砷元素的信号值,绘制标准曲线;将6种砷形态混合标准溶液按照浓度从低到高依次在HPLC-ICP-MS中进样,对各砷形态化合物的色谱峰面积进行积分,绘制标准曲线。

1.2.5.2 检出限和定量限 通过对空白溶液连续测定11次,以空白样品的信号值计算出标准偏差值,以测定结果标准偏差值的3倍计算检出限,以测定结果标准偏差的10倍计算定量限。

1.2.5.3 精密度和回收率实验 为了验证实验结果的准确性,将标准参考物质SRM 1566b中分别加入不同水平的标准品,进行加标回收实验,采用HPLC-ICP-MS法测定其中砷形态含量,并计算其回收率。

1.2.6 样品的测定 将每种贝类样品设置6个平行样(n=6),按照上述实验方法进行前处理,采用ICP-MS分析总砷含量,HPLC-ICP-MS分析砷形态化合物含量,测定数据为6次测定的平均值。

1.2.7 健康风险评估 采用USEPA推荐的日暴露计算方法和健康风险模型评价贝类中砷的健康风险。日膳食暴露量(estimated daily ingestion,EDI)的计算公式为:

式中:EDIiAs为iAs的日膳食暴露量(mg/(kg·d));CiAs为贝类样品中iAs含量(mg/kg);DIR为目标人群贝类的摄入量(0.0389 kg/d);BW为目标人群的平均体重(63 kg)[13]。

采用危害商数(target hazard quotient,THQ)来评价由于摄入污染物对人体健康造成的潜在风险。THQ是污染物的估计剂量与参考剂量的比值,如果比值超过安全基准1,则说明这种污染物对人体具有潜在的健康风险[14]。计算公式为:

式中:THQiAs为无机砷的危害商数;RfDiAs为无机砷的口服参考剂量(3.0×10-4mg/(kg·d));EF为暴露频率(365 d/year);ED为暴露年限(70 years);AT为暴露平均时间(25550 d)[15]。

采用致癌风险(carcinogenic risk,CR)来评估摄入贝类后无机砷对人群产生的健康风险。计算公式为:

式中:CRiAs为癌症风险概率;SFiAs(kg·d/mg)为砷的致癌因子(1.5 kg·d/mg)[16]。

1.3 数据处理

本研究中实验中设置6组平行,数据以平均值±标准偏差表示;数据处理软件采用MassHunter软件,数据分析通过Eexcel 2016和SPSS 25.0,绘图软件采用Origin Pro 9.0。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

采用浓度分别为30、40、50、60 mmol/L的碳酸铵水溶液(pH=9.5)作为流动相分离6种砷形态化合物,4种不同浓度碳酸铵下的HPLC-ICP-MS色谱图如图1a所示。由图1a可知,随着碳酸铵的浓度增加,六种砷形态化合物的洗脱时间缩短,尤其是As(V)和MMA,但AsC和AsB的洗脱时间基本不变。当流动相浓度超过50 mmol/L时,As(Ⅲ)与DMA分离效果不佳。因此流动相碳酸铵的最佳离子浓度为50 mmol/L,在该条件下,6种砷形态化合物可在12 min内洗脱,对比Jasrotia等[17]分析海藻植物中中五种砷形态化合物需要18 min,分析效率得以提高。

采用pH分别为9.0、9.3、9.5、9.8的碳酸铵(50 mmol/L)作为流动相分离6种砷形态化合物,4种不同pH条件下的HPLC-ICP-MS色谱图如图1b所示。由图1b可知,随着流动相pH增加,AsC、AsB、DMA、As(V)的洗脱时间几乎不受影响,但As(Ⅲ)逐渐电离,信号增加,并且出峰时间延后。当流动相pH为9.8时,As(Ⅲ)与MMA不能达到基线分离。综合考虑As(Ⅲ)的信号值与色谱分离效果,选择流动相B的pH为9.5,此时6种砷形态化合物均可获得良好的分离效果,且峰形尖锐。

图1 砷形态化合物在不同条件下的HPLC-ICP-MS色谱图Fig.1 HPLC-ICP-MS chromatograms of As species standards under different conditions注:1:AsC,2:AsB,3:As(Ⅲ),4:DMA,5:MMA, 6:As(V);a:不同离子浓度;b:不同pH。

2.2 提取条件对贝类中砷形态物质提取效率的影响

为了确定贝类样品中砷形态化合物的组成,需要选择合适的提取条件进行前处理,既要保证砷形态化合物稳定的同时,又能够达到较好的提取效率(提取六种砷形态总和/样品中总砷含量)。本研究以标准参考物质SRM 1566b为原料,采用四种不同的酸性试剂硝酸、甲酸、盐酸、三氟乙酸进行提取,提取效率如图2a所示。结果表明,在酸浓度一定(0.3 mol/L)时,硝酸对砷形态的提取效率优于其他提取试剂。在选择以硝酸作为提取试剂后,分别比较浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L的硝酸溶液作为提取试剂对提取效果的影响,提取效率如图2b所示。结果表明,随着硝酸浓度的增加,提取效率不断升高,说明酸有利于从贝类基质中提取砷形态化合物,而当硝酸浓度大于0.15 mol/L时,提取效率基本保持不变。考虑到酸性过高对色谱柱寿命的影响,本研究采用0.15 mol/L硝酸作为提取试剂进行贝类中砷形态化合物的提取实验。

图2 标准参考物质SRM 1566b在不同提取条件下砷的提取效率Fig.2 Extraction efficiency of As species from SRM 1566b under different conditions注:a:不同种类的提取试剂;b:不同浓度的提取试剂。

2.3 CRC模式的选择

采用ICP-MS在不同CRC模式(SQ模式无气模式、SQ模式的He碰撞模式和MS/MS模式下的O2反应模式)下进行总砷浓度的测定。砷元素在不同碰撞/反应模式下的线性方程、相关系数、背景等效浓度、检出限和定量限见表1。由表1可知,本实验三种模式下砷元素的标准曲线相关系数均达到0.9995以上,说明元素的信号值与浓度呈现出良好的线性关系。在No gas模式下,砷的背景等效浓度达到3.651 μg/L,表明在电感耦合等离子体质谱测定砷元素时存在着严重的多原子离子干扰(40Ar35Cl、40Ar34SH、40Ca35Cl)。在He碰撞模式下,砷元素的背景等效浓度降低到0.008 μg/L,虽然通过动能歧视和干扰离子碰撞解离使得多原子离子干扰基本被消除,但是对比He模式和其他模式下砷元素的标准曲线可知,其信号大大降低,这是因为在He模式下,不仅多原子离子会被消除,大量的75As+也会有能量损失,从而导致目标离子灵敏度受损严重。在O2模式下,第一个四极杆过滤器设为质荷比(m/z)=75,通过在碰撞/反应池中的质量转移反应,将75As+转移(shift)为75As16O+,第二个四极杆过滤器设置目标离子为(m/z)=91,而40Ar35Cl+、40Ar34SH+、40Ca35Cl+以及由稀土元素形成的双电荷离子(150Sm++和150Nd++)不能与O2发生质量转移反应,不仅能去除多原子离子干扰,还可以除去He模式下无法消除的双电荷离子干扰,砷元素的背景等效浓度(BEC)降到了0.006 μg/L,而且相比于He模式灵敏度明显提高,所获得元素As的检出限为0.009 μg/L,定量限为0.030 μg/L。Zhu等[18]通过ICP-MS中He模式分析砷元素,检出限为0.1 μg/L,本研究采用O2模式,砷元素的检出限更低,

表1 三种CRC模式下砷元素的分析性能Table 1 Analytical performance of three modes on arsenic

同时GB 5009.11-2014《食品中无机砷的测定 液相色谱-电感耦合等离子体质谱法》[19]也推荐使用碰撞/反应池技术来测定样品中砷元素。综上,在本研究中,MS/MS模式下的O2反应模式测定砷元素具有良好的分析性能。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准工作曲线及检出限、定量限 对六种砷形态化合物标准混合溶液进行HPLC-ICP-MS进行分析,以峰面积(y)对浓度(x,μg/L)进行线性回归,同时将6种砷形态溶液按照浓度从低到高依次进样,将信噪比S/N≥3时标准品的浓度定为检出限,将S/N≥10时标准品的浓度定为定量限,实验结果如表2所示。结果表明,在碰撞/反应池的O2模式条件下,6种砷形态化合物在一定浓度范围内都呈现良好的线性关系,相关系数均在0.999以上,6种砷形态化合物检出限为0.009～0.028 μg/L。Chen等[20]采用HPLC-ICP-MS中He模式分析蘑菇中砷元素形态,6种砷化合物的检出限为0.31～0.59 μg/L,本文建立的方法通过采用碰撞/反应池技术,在检测灵敏度上已经超过了该方法。综上所述,本研究建立的CRC-ICP-MS元素分析方法具有很高的检测灵敏度,适合水产品中砷形态化合物的定量分析。

表2 六种砷形态的标准曲线和灵敏度Table 2 Standard curves and sensitivity of six As species

2.4.2 精密度实验 为了验证本研究中建立的HPLC-ICP-MS方法的准确性,按照上述选定的实验步骤和分析条件,对标准参考物质SRM 1566b进行分析,重复测定6次,分析结果见表3。由实验结果可知,该方法具有良好的日内精密度和日间精密度(均小于10%),表明该方法具有较高的精密度和良好的准确性。

表3 标准参考物质分析结果Table 3 Analytical results of certified reference materials

2.4.3 加标回收实验 本研究采用加标回收率来进一步验证方法的准确性,在标准参考物质SRM-1566b中分别添加3种浓度水平的砷胆碱、砷甜菜碱、三价砷、一甲基砷、二甲基砷和五价砷的标准溶液,按照上述实验进行处理测定,测定样品加标前后六种砷形态化合物的浓度,计算加标回收率(n=6),结果见表4所示。实验结果显示,6种砷形态的回收率介于91.2%～106.2%,RSD介于3.2%～8.6%说明该方法有良好的重现性,满足分析测试的要求。综上所述,本研究中建立的方法能准确分析水产品中6种砷形态化合物的含量。

表4 样品加标回收率结果Table 4 Recoveries of arsenic species from spiked samples

2.5 贝类样品中总砷含量的测定

采用微波消解法进行前处理,运用ICP-MS中O2模式,以72Ge为内标,对牡蛎、蛤蜊、毛蚶、扇贝、缢蛏、竹蛏、青口贝、北极贝、夏威夷贝9种贝类样品中的总砷含量进行测定,结果如表5所示。由表5可以看出,在测定的9种贝类(以湿重计)中,砷含量为0.70～1.79 mg/kg,其中竹蛏中砷含量最高,为1.79 mg/kg。Zmozinski等[21]分别研究了巴西和西班牙的海产品甲壳类、鱼类、双壳类中总砷含量(以干重计),从1.2～35.2 mg/kg之间,尤其是双壳类动物中,砷平均含量达到15.0 mg/kg,其中无机砷含量占总砷含量的2.4%～5.8%。

表5 不同贝类中总砷含量Table 5 The contents of arsenic in different species of shellfish

根据GB2762-2017《食品中污染物限量》[22]中要求,海产品中贝类中无机砷含量小于0.5 mg/kg,为了对上述九种贝类进行无机砷风险评估,因此还需要进一步研究测定贝类中无机砷含量才能给出科学的食用安全性评价。

2.6 贝类样品中砷形态测定与风险评估

采用优化好的前处理条件(0.15 mol/L硝酸溶液)、色谱分离条件(50 mmol/L碳酸铵)及ICP-MS中CRC的O2模式测定贝类样品中砷形态化合物组成及其含量。分析结果如表6所示,在测定的九种青岛市售贝类样品中,砷元素主要以砷甜菜碱为主,约占总砷含量的59.4%～87.1%,无机砷含量在0.014～0.283 mg/kg,均低于中国食品安全国家标准中对贝类中无机砷(0.5 mg/kg)的限量[22]。

表6 贝类中6中砷形态化合物的浓度Table 6 Concentrations of six arsenic species in shellfish

在本研究中,通过EDIiAs、THQiAs、CRiAs来进一步评估人群摄入贝类后可能产生的危害,结果如表7所示,对于所测九种贝类样品,无机砷的日摄入量在8.644×10-6～1.265×10-4mg/kg·d,危害商数THQ均小于1,说明青岛市售的九种贝类就无机砷的食用安全性来说是安全的。但通过致癌因子CR可以看出,缢蛏、竹蛏、青口贝的致癌因子均大于无机砷致癌因子的最大可接受值(1×10-4)[23],说明应该适当减少部分贝类的食用量和使用频率,以减少无机砷在体内蓄积,从而降低其致癌等危害。

表7 贝类的日摄入量及健康风险评估Table 7 Estimated daily intake and potential health risk from consumption of shellfish

3 结论

实验研究了CRC不同模式下方法的准确性,表明O2反应模式是准确测定总砷及砷形态化合物的最佳定量方法。以0.15 mol/L硝酸作为提取试剂对贝类砷化合物进行提取,提取效率达90%,采用HPLC-ICP-MS法测定贝类样品中As(Ⅲ)、As(V)、MMA、DMA、AsB和AsC六种砷形态化合物时,优化液相条件,以50 mmol/L碳酸铵(pH=9.5)进行梯度洗脱,使得6种砷形态化合物在12 min内得以分离,方法学考察显示,该方法6种砷形态化合物检出限为0.009～0.028 μg/L,日内精密度和日间精密度均小于10%,加标回收率介于91.2%～106.2%,具有良好的分析性能。

分析青岛市售9种贝类样品中砷元素和形态分布,结果表明,贝类中总砷浓度较高(0.70～1.79 mg/kg),但通过砷形态的测定结果发现,砷元素在贝类中主要是以无毒性的砷甜菜碱形式存在,约占总砷含量的59.4%～87.1%。根据风险评估的结果,青岛市售的九种贝类样品对人体基本没有危害,但持续大量摄入部分贝类(缢蛏、竹蛏、青口贝)可能会产生潜在的致癌风险。本研究所建立的高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法方法灵敏度高,分析速度快,结果稳定准确,为食品中重金属污染的安全性评价提供了指导。