自身免疫性肝病重叠综合征患者外周血中调节性T淋巴细胞水平研究

张小丹，陈 杰，韩 莹，黄云丽，黄春洋，刘燕敏，廖惠钰，单 晶

（首都医科大学附属北京佑安医院 肝病免疫科，北京 100069）

自身免疫性肝病包括自身免疫性肝炎（au- toimmune hepatitis，AIH）、原发性胆汁性胆管炎（primary biliray cholangitis，PBC）、 原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）和重叠综合征。部分患者可同时或在病程的不同阶段存在2种自身免疫性肝病的临床、血清学、组织学特征，称为自身免疫性肝病重叠综合征，以AIHPBC重叠综合征（autoimmune hepatitis-primary biliary cholangitis overlap syndrome，AIH-PBC OS）最为多见，约占AIH患者的10%[1，2]。迄今为止，包括重叠综合征在内的自身免疫性肝病的发病机制仍不清楚，有研究报道调节性T淋巴细胞在AIH的发生发展过程中发挥了重要作用[3]。因此我们回顾观察了近年来收治的23例AIH-PBC重叠综合征患者调节性T淋巴细胞的分布特点，与同期的AIH患者和健康人群进行对比，探讨调节性T淋巴细胞亚群特征与AIH-PBC重叠综合征发病的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2013年1月～2018年1月首都医科大学附属北京佑安医院肝病免疫科的就诊患者。AIH组纳入患者94例，男11例、女83例；年龄 21～82 岁，平均（52.2±12.3）岁。 纳入标准：（1）AIH诊断符合1999年国际自身免疫性肝炎小组（IAIHG）修正的AIH诊断计分系统：治疗前IAIHG 评分≥10 分[4]；（2）I型 AIH：抗核抗体（antinuclear antibodies，ANA）和（或）抗平滑肌抗体（anti-smooth muscle antibody，SMA）阳性；（3）未经糖皮质激素及免疫抑制剂治疗。

纳入重叠综合征（OS）组AIH-PBC OS患者23例，男3例、女20例；年龄33～78岁，平均（53.2±11.1）岁。 纳入标准：（1）参照 1998 年 Chazouillems等提出的AIH-PBC重叠综合征诊断标准（巴黎标准），即AIH和PBC 3项诊断标准中的各2项同时或者相继出现[5]。AIH诊断标准包括：①血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）＞5U/L。②血清免疫球蛋白G（IgG）≥2U/L或血清SMA阳性。③肝脏组织学提示中重度界面性肝炎。PBC诊断标准包括：①血清ALP≥2U/L或血清GGT≥5U/L；②血清抗线粒体抗体（antimitochondrial antibodies，AMA）阳性；③肝脏组织学表现为非化脓性破坏性胆管炎。（2）未经糖皮质激素及免疫抑制剂治疗。

健康对照组：健康体检者20人，其中男2例、女18例；年龄50.8±9.5岁。3组患者年龄、性别差异无统计学意义（均 P＞0.05）。

1.2 排除标准

（1）合并 Wilson病、遗传性疾病、药物性肝炎、中毒性肝病、酒精性肝病和甲、乙、丙、丁、戊肝炎病毒感染或其他嗜肝病毒感染等；（2）年龄＜16岁；（3）合并恶性肿瘤；（4）IgG4 相关性疾病。

1.3 实验室检查

使用日本Olympus AU 5400全自动生物化学分析仪检测ALT、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）和白蛋白（ALB）（上海科华生物制品有限公司）；采用ELISA法检测自身抗体（购自德国欧蒙医学实验诊断有限公司）。凝血功能检测采用日本Sys-mex CA-7000全自动血凝仪；血清总IgG采用美国Beckman coulter Array 360全自动特种蛋白分析仪检测。

1.4 调节性T淋巴细胞检测

使用美国BD公司生产的BDFACSCantoⅡ型流式细胞仪检测，试剂主要包括CD4-FITC试剂盒、CD25-PC5试剂盒（美国贝克曼公司）、anti-FOXP3抗体（美国invitrogen公司）等。取全血50μl按要求上机检测。应用BDFACSDiva software软件系统进行分析。检测项目包括辅助性T细胞/淋巴细胞比值、CD4+CD25+T/辅助性T细胞比值、CD4+CD25-T细胞/辅助性 T细胞比值和Treg细胞（CD4+CD25+FOXP3+T细胞）/辅助性T细胞比值。调节性T淋巴细胞检测和肝功能及免疫球蛋白检测于同一天抽血完成。患者上述检查均完成于保肝对症治疗期间，部分拟予免疫抑制剂治疗患者在开始免疫抑制剂治疗前完成。

1.5 肝穿病理检测

37例AIH、5例AIH-PBC OS患者外院完成肝穿病理检查并确诊。57例AIH、18例AIHPBC OS患者入院后完成肝穿病理检查后确诊。我院肝穿病理检查采用B超引导下MAGNUM活检系统（Bard Peripheral Vascular，Inc，美国）经皮穿刺取肝组织，穿刺肝组织长度＞1.0cm；标本采用10%甲醛溶液及时固定，石蜡包埋。连续切片后行HE、Masson三色、Gomori网织纤维和 D-PAS染色。由2名病理医生独立完成阅片[6]。

1.6 治疗方法

入院后所有患者均予甘草类制剂、水飞蓟素、双环醇等保肝对症治疗；合并胆汁淤积症的AIH和重叠.综合征组患者予熊去氧胆酸治疗。

1.7 统计学方法

表1 2组患者一般资料、生化及免疫指标比较

应用SPSS16.0软件进行统计学处理。计量资料呈正态分布者以均数±标准差表示，组间比较采用t或单因素方差分析检验；呈偏态分布者以中位数表示，组间比较采用Mann-Whitney检验。计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用字2检验或Fisher确切概率法。3组的差异性检验采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。

2 结果

2.1 患者一般资料、生化及免疫指标比较

表1示，2组患者 ALT、AST、TBIL、ALB、INR、ANA阳性率及ASMA阳性率差异均无统计学意义。OS组患者GGT、ALP、IgG水平均显著高于AIH 组（均 P＜0.05）。

表2 各组的调节性T淋巴细胞特征

2.2 各组调节性T淋巴细胞特征

3组检测对象组间比较，辅助性T细胞/淋巴细胞比值、CD4+CD25+T/辅助性T细胞比值、CD4+CD25-T细胞/辅助性T细胞比值无显著性差异（均 P＞0.05）。 而 Treg细胞（CD4+CD25+FOXP3+T细胞）/辅助性T细胞比值存在显著性差异（P=0.004，见表2）。 两两比较提示：CD4+CD25+T/辅助性T细胞比值，健康对照组显著高于AIH组（P=0.001），也高于 OS 组（P=0.008）；AIH 组和 OS 组之间无显著性差异（P=0.994）

3 讨论

AIH-PBC重叠综合征是重叠综合征中最常见类型，但其发病机制的研究少有报道[2，7]。CD4+辅助性T细胞作为机体免疫系统的主要效应细胞在稳定机体的免疫平衡、维持机体免疫耐受等免疫机制中发挥了重要作用，其中CD4+CD25+FOXP3+的Tregs细胞主要用于维持自身免疫稳定，识别自身抗原并抑制自身反应性T细胞的免疫反应，参与机体的免疫自稳[8]。近年来相关研究证实Tregs细胞在1型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病和类风湿性关节炎等自身免疫相关疾病的发生发展中发挥了相当关键的作用[9]。在自身免疫性肝炎方面，Longhi等[10]报道自身免疫性肝炎患者体内Tregs细胞数目下降，FOXP3表达减少，而CD8+T细胞自发性凋亡较少，活性增强，提示Tregs细胞比例减少导致患者自身免疫过度，进而导致自身免疫损害形成自身免疫性肝炎。在本研究中AIH组患者Treg细胞/辅助性T细胞比值均显著低于对照组（P＜0.05），与 Longhi MS 等研究结果类似[10，11]。同时OS组患者Treg细胞/辅助性T细胞比值也显著低于对照组（P＜0.05）；与 AIH组比较，无显著性差异（P＞0.05）。提示AIH-PBC重叠综合征患者可能与AIH患者类似免疫损伤机制，即Tregs细胞比例减少导致肝脏自身免疫过度反应，进而引起肝脏免疫炎症。

本研究入选的2组病例中检测调节性T细胞的同时也进行了肝功能、凝血功能、自身抗体及免疫球蛋白检测。AIH-PBC重叠综合征患者采用巴黎标准诊断，纳入病例的IgG和ALP、GGT水平均较高，虽经过保肝对症及熊去氧胆酸治疗，患者胆汁淤积等指标得到一定程度改善，但仍高于AIH组（P＜0.05）。相关研究认为自身免疫性肝病患者T细胞亚群和Tregs细胞水平与ALT存在负相关[12]，但其他急性肝损伤，如药物性肝损伤等也可以导致Tregs细胞比值一过性降低[6]。为保证各组患者免疫球蛋白、肝功能指标和调节性T细胞检测的可比性，这些检查均选择同日检测完成，本组患者在入院后均予保肝对症治疗，肝脏急性炎症得到一定程度的控制，转氨酶水平有所改善，我们比较了2组患者 ALT、AST、TBIL、ALB、INR 指标，差异均无统计学意义。因此我们认为本研究是在肝功能受损程度类似的前提下2组患者因免疫功能异常所致Tregs细胞水平变化的真实反映，而不是受其他致ALT水平升高的肝损害原因引起的Tregs细胞水平的一过性改变。

与AIH比较，AIH-PBC重叠综合征的免疫机制研究更为缺乏。基于AIH-PBC重叠综合征的临床和病理特征，既往我们推测其与AIH可能存在某些相似的免疫发病机制。本研究的结果证实AIH和AIH-PBC重叠综合征均有Tregs细胞比例下降的特点，可为下一步AIH-PBC重叠综合征的发病机制的研究和治疗策略的改进提供线索。但AIH-PBC重叠综合征发病率低，病例入选难度较大，因此该研究样本量小，AIH-PBC重叠综合征确切的免疫发病机制尚待进一步的研究。