甲巯咪唑脂质体凝胶的制备和体外透皮性能考察

王晓慧,罗湘军,曾燕

(邵阳学院 1.药学院；2.附属第二医院，湖南 邵阳，422000)

甲巯咪唑(thiamazole)为治疗甲状腺功能亢进症的一线药物，口服给药常出现粒细胞减少，甚至出现肝功能损害。有研究表明甲巯咪唑口服给药的血药浓度虽然明显高于经皮给药的血药浓度，但甲状腺组织中的药物浓度无显著性差异，提示经皮给药的全身不良反应小于口服给药，与口服给药相比，甲巯咪唑经皮给药具有起效快，全身不良反应小的特点[1]。近年来，脂质体作为药物载体系统能减少药物不良反应，并具有良好的治疗靶向性、缓释性得以迅速发展和广泛应用[2]。本实验通过应用逆向蒸发一超声法制备甲巯咪唑脂质体[3]，卡波姆940加为基质，分别加入 2%桉叶油、2%薄荷、2%月桂醇氮酮为促渗剂，制备脂质体凝胶。通过离体大鼠腹皮结合改良 Franz 扩散装置考察了不同促渗剂体外透皮特性运用，优化后的脂质体凝胶与市场复方甲巯咪唑软膏进行了体外透皮特性比较和评价，旨在为该药物的制剂后期开发提供其在体内释放过程规律的参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

日本岛津LC—2100C型高效液相色谱仪，岛津工作站CLASS—VP 6.12版。Spect ra 100 紫外检测器。AB204—N电子分析天平，真空干燥箱。旋转蒸发器RE-52AA(上海亚荣生化仪器)。

1.2 试药

甲巯咪唑对照品(上海金穗生物科技公司，≥99.0%);内标为邻苯二酚(分析纯，上海试剂总厂);甲醇(色谱纯，天津四友医学生物技术公司);磷脂(德国Nattermann公司，批号S180207);胆固醇(美国Sigma公司，批号0017065);卡波姆940(西安天正药用辅料有限公司，批号20180423)；月桂醇氮酮(上海山浦化工有限公司，批号20160201);5%复方甲巯咪唑软膏(山东齐鲁制药有限公司,批号1811002)。

1.3 动物

Wistar大鼠雌雄各半，体重(200±20) g，由邵阳学院实验动物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 甲巯咪唑脂质体的制备

处方：磷脂0.25 mol、胆固醇0.1 mol分别加入甲巯咪唑0.01 mol，磷酸缓冲盐溶液(pH 6.8)至100 mL，采用逆向蒸发一超声法按文献[3]制备以备用。

1.4.2 甲巯咪唑脂质体凝胶的制备

称取2.0 g卡波姆940，均匀分散于96 mL蒸馏水中，充分湿润后加入磷酸缓冲盐溶液(pH 6.8)4 mL，充分搅拌，溶胀过夜，三乙醇胺调整 pH为6.0～6.8，得到凝胶基质。

甲巯咪唑脂质体与凝胶基质等量混合得到甲巯咪唑脂质体凝胶。

1.4.3 甲巯咪唑检测的色谱条件

色谱柱：Lichrospher C18 柱(150 mm ×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇∶水为17∶83；检测波长：252 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL 。

1.4.4 标准曲线的制定方法

精密称取甲巯咪唑标准品0.1 g至100 mL容量瓶中，加0.9%的氯化钠至刻度，作为标准溶液备用。依次精密量取上液0.1、0.2 、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，均加入0.9%的氯化钠溶液定容。按甲巯咪唑检测的色谱条件分别进样 20 μL，以峰面积(A)对浓度(C)进行线性回归。

1.4.5 精密度实验

分别精密量取甲巯咪唑标准品溶液0.1、0.6、2.5 mL至50 mL容量瓶中，加入0.9%的氯化钠溶液定容，分别配成低、中、高质量浓度(2.0、12.0、50.0 mg/L)的甲巯咪唑生理盐水溶液。

取低、中、高质量浓度(2.0、12.0、50.0 mg/L)的甲巯咪唑生理盐水溶液，按甲巯咪唑检测的色谱条件，1 d内重复进样3次，每次进样20 μL，测定甲巯咪唑浓度，计算日内相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。将上述样品相同条件下5 d内连续每天进样 20 μL，计算日间RSD。

1.4.6 回收率实验

取低、中、高质量浓度(2.0、12.0、50.0 mg/L)的甲巯咪唑生理盐水溶液，按照甲巯咪唑检测的色谱条件，每个浓度重复测定3次，测得回收率。

1.4.7 甲巯咪唑脂质体凝胶中不同促渗剂对经皮渗透的影响

1.4.7.1 制备含不同促渗剂的脂质体凝胶

取25 mL甲巯咪唑脂质体与凝胶基质25 mL混合均匀，加甘油0.2 g，月桂醇氮酮1.0 g，磷酸缓冲盐溶液(pH 6.8) 4 mL，然后用三乙醇胺调节其 pH 值在 6.0～6.8，即制得甲巯咪唑含量为57 μg/mL的均匀、细腻黏稠状乳白色脂质体凝胶，置于4 ℃保存。

1.4.7.2 含不同促渗剂的脂质体凝胶的药物体外透皮释放浓度的测定

取含不同促渗剂(桉叶油、薄荷、月桂醇氮酮，浓度均为2%)的脂质体凝胶，以不含促渗剂的甲巯咪唑水凝胶贴剂为对照，考察不同促渗剂对甲巯咪唑经皮渗透的影响。按甲巯咪唑检测的色谱条件测定相应的药物浓度。

1.4.8 甲巯咪唑凝胶的体外透皮实验

1.4.8.1 离体皮肤的制备

取雄性大鼠，断颈处死，脱毛，去除皮下组织冲洗干净，生理盐水中浸泡30 min后，取出吸干，于-20 ℃冷冻保存备用，实验前自然解冻。

1.4.8.2 体外透皮试验

将处理好的鼠皮用夹子固定，置于水平扩散池的两个半池之间，角质层面向给药池，真皮面向接收池，扩散池有效渗透面积为2.80 cm2，接收池容积为 6 mL。改良Franz 扩散装置加入7 mL 生理盐水作为接收液，称取甲巯咪唑脂质体凝胶、乳膏样品各1 g分别均匀涂抹于大小相同的大鼠离体皮肤上，扩散池置于恒温(37.0±0.5)℃水浴槽中，以磁力搅拌器持续搅拌，于0.5、1.0、 2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0 h取出5.0 mL接收液，同时补足同体积的空白接收液。5.0 mL 接收液离心后的样品上清液微孔滤膜过滤，取续滤液按甲巯咪唑检测的色谱条件测定相应的药物浓度Cn，按q=CV计算渗透量(q)，然后分别计算不同时间内的累积释放率(Q)。

1.4.8.3 曲线拟合

将甲巯咪唑脂质体凝胶和复方甲巯咪唑软膏的累积释放率(Q)与时间(t)进行零级、一级、Higuchi用OriginPro 8.0软件模拟拟合。

2 结果

2.1 标准曲线

按标准曲线制定方法测定，得线性方程：C=0.007 8A+0.623 5，r=0.999 4(n=8)。表明在10～90 mg/L范围内药物浓度与峰面积有良好的线性关系。见图1。

1-甲巯咪唑 2-内标图1 色谱图Fig.1 Chromatogram

2.2 回收率实验

按回收率试验方法测定并计算回收率(n=3)，均值为101.18%。

2.3 精密度实验

按精密度实验方法测定并计算日内RSD均值(n=3)为1.18%；日间RSD均值(n=5)为1.53%。表明样品稳定性良好，本方法符合要求。

2.4 不同促渗剂对其经皮渗透的影响

实验结果表明，三种促渗剂对甲巯咪唑脂质体凝胶均有不同程度的促渗作用，尤以月桂醇氮酮最佳。故选用月桂醇氮酮作为促渗剂，浓度为2%，见图2。

1-月桂醇氮酮 2-薄荷 3-桉叶油 4-空白图2 不同促渗剂下甲巯咪唑脂质体凝胶的药物渗透吸收比较Fig.2 Comparison of drug permeation and absorption of methimazole liposome gels with different permeation promoters

2.5 甲巯咪唑脂质体凝胶与复方甲巯咪唑软膏的体外透皮性能比较

将相同含药量的甲巯咪唑脂质体凝胶与市售复方甲巯咪唑软膏的体外透皮性能进行了比较，结果见图3 。

1-脂质体凝胶; 2-软膏图3 甲巯咪唑脂质体凝胶与复方甲巯咪唑软膏经皮渗透吸收比较Fig.3 Comparison of transdermal osmotic absorption of thimidazole liposome gel and compound thimidazole ointment

将甲巯咪唑脂质体凝胶和复方甲巯咪唑软膏的累积释放率(Q)与时间(t)进行零级、一级、Higuchi用OriginPro 8.0软件模拟拟合，体外释放拟合方程见表1。

表1 体外释放拟合方程Table 1 In vitro release fitting equation

由图3可知，甲巯咪唑脂质体凝胶和复方甲巯咪唑软膏体外透皮吸收存在一定差异，拟合结果表明体外释放过程均符合Higuchi方程。根据复方甲巯咪唑软膏的药物渗透曲线，可以看出用药8 h达到释放高峰，12 h内药物累积渗透量略高于甲巯咪唑脂质体凝胶，随之释放快速停止；对于甲巯咪唑脂质体凝胶的药物渗透曲线，用药15 h达到释放高峰，36 h仍有释放(36 h后没有继续考察)，36 h药物累积渗透量(82.01%)高于对照制剂复方甲巯咪唑软膏(70.99%)，可长时间持续稳态释药，具有缓释的效果。

3 讨论

甲巯咪唑为小分子亲水性化合物，限于其理化性质，其乳膏和凝胶均难以吸收透过皮肤角质层。有研究发现磷脂是两性分子，在水相中形成亲水头部向外、疏水部向内的囊泡结构[4]。有研究表明脂质体很容易包封脂溶性药物，粒径≤300 nm的脂质体能将活性药物有效递送到皮肤深层[5]。其选择性高，靶向性强，具有减少药物剂量、降低毒副作用、无免疫原性、缓慢释放、降低体内消除速度、保护药物提高稳定性等特点[6]。本研究制备的脂质体，平均粒径控制在170 nm 左右[3]。将甲巯咪唑包封于类脂质双分子层形成的脂质体中间，体外释放度及体外透皮实验研究表明，甲巯咪唑脂质体凝胶剂具有良好的透皮效果，36 h释药平稳，具有缓释作用。

月桂醇氮酮是目前常用的药物经皮渗透促进剂，尤其是对亲水性药物具有较好的促渗透效果[7-8]。按上述方法分别制备的脂质体凝胶具有吸收速度快、生物利用度高、生物相容性良好、质地均匀、易于涂展和洗除、皮肤给药不妨碍皮肤正常功能的特点。本实验研制的甲巯咪唑脂质体凝胶，与软膏比较，具有透皮吸收更好并可缓控的特点。但脂质体的靶向性、远期稳定性及凝胶的使用剂量控制仍有待进一步研究。