水通道蛋白基因在子宫腺肌病患者子宫内膜中的表达及其意义

贾利平，王炳淑， 刘玉珠， 周小飞，王发辉

子宫腺肌病(adenomyosis，ADS)是一种病理状态，其特征是子宫内膜组织存在异常组织如上皮细胞和基质细胞[1-3]。根据术中和组织病理学发现，ADS可归为4种不同的类型，即弥漫性、硬化性、结节性和囊性。大约2/3的ADS女性患有月经过多、痛经和子宫增大的症状，在低生育力的女性中占有很高比例[4-5]。但是，ADS的病因和发病机制仍然知之甚少。子宫腺肌病是一种雌激素依赖性炎性反应疾病。除了激素调节之外，还报道了许多其他因素，包括炎性细胞因子聚集、神经支配重塑、血管生成增加。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一类存在于细胞膜的小分子蛋白，研究表明水通道蛋白家族有广泛的功能：促进水分子的快速被动运输；调节细胞内外渗透压的平衡；促进细胞迁徙；调节脂肪代谢；神经信号传导等[6-8]。AQP不仅在组织水转运中起到重要作用，也参与了细胞增殖、凋亡、迁移、吞噬和神经信号传导等过程。研究证实AQP1、AQP2、AQP5、AQP8在子宫内膜异位症中的在位内膜和异位内膜中都有表达[9]。同时研究发现，在子宫内膜异位症中AQP1主要表达于在位内膜和异位内膜的微血管和小血管上，而AQP2、AQP5、AQP8主要表达于在位内膜和异位内膜的腺上皮和腔上皮细胞上。本研究拟探讨AQP1、AQP2、AQP5与AQP8在子宫腺肌病患者子宫内膜中的表达及其意义，为子宫腺肌病的治疗提供理论依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月—2019年4月海南医学院第二附属医院妇科收治子宫腺肌病患者104例作为ADS组， 78例患有肌瘤或宫颈上皮内瘤变Ⅲ度的妇女为对照组。ADS组年龄27～47(37.6±9.3)岁，孕产史G1P1；对照组年龄27～47(37.1±9.1)岁，孕产史G1P1。所有研究对象在生育年龄(25～46岁)进行子宫切除术，获取其子宫内膜。研究对象在手术前至少3个月未接受激素治疗，且无恶性肿瘤或自身免疫性疾病史。获取子宫腺肌病患者及对照组子宫内膜后，将组织立刻置于-70℃冰箱保存，用于后续相应指标的检测。本研究经医院伦理审查委员会批准，患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 观察指标与方法

1.2.1 AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA在子宫内膜组织表达的测定：使用InvitrogenTMTRIzolTM试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司生产)根据说明从子宫内膜组织中提取总RNA。RNA量通过Nano Drop ND-2000分光光度计(光密度260 nm，美国Nano Drop公司生产)测量，并使用标准变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。用PrimeScriptTMRT试剂盒(日本Takara公司生产)合成cDNA，并使用SYRT PremixEx TaqTM试剂盒(日本Takara公司生产)在Roche LightCycler 480(瑞士Roche公司生产)中进行RT-PCR。为检测子宫内膜AQP1、AQP2、AQP5、AQP8表达水平，本研究使用miRNeasyTMMini试剂盒(德国Qiagen公司生产)根据说明提取总RNA(包括microRNA)。使用miRCURY LNATMUniversal cDNA Synthesis试剂盒Ⅱ(丹麦Exiqon A/S公司生产)合成cDNA，并使用miRCURY LNATMExiLENTSYBR-Green Master Mix(丹麦Exiqon A/S公司生产)进行RT-PCR。AQP1、AQP2、AQP5、AQP8表达水平分别归一化为U6表达水平。使用2-ΔΔCt方法计算相对表达水平。AQP1引物：5'-GCTGGTTTTCTTTGCTAGCCC-3'(正向)和5'-CACCGGCAGGGTCTGTATTC-3'(反向)，AQP2引物：5'-CCGTACGTATCTTTGCCCGTTAG-3'(正向)和5'-CCGTAGCAGGGTCTCGTACG-3'(反向)，AQP5引物：5'-CCTGGACTTCTTTGCCGTGA-3'(正向)和5'-CACCGGCAGGGTCTGTATTC-3'(反向)，AQP8引物：5'-CCGTGATTCTTTGCGGTAGC-3'(正向)和5'-CACCGGCAGGGTCTGTATTC-3'(反向)，U6引物：5'-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3'(正向)和5'-AGGAATCCTTCTGACCCATGC-3'(反向)。

1.2.2 AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白在子宫内膜组织表达的测定：使用免疫组织化学方法检测AQP1、AQP2、AQP5、AQP8在子宫内膜组织样品中的表达。兔抗人AQP1、AQP2、AQP5、AQP8多克隆抗体(1∶800)由美国Cell Signaling Technology公司提供。山羊抗兔二级多克隆抗体(1∶1 000)由Cell Signaling Technology公司提供；DBA试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司。常规进行免疫组织化学方法检测AQP1、AQP2、AQP5、AQP8水平。根据Remmele方法计算免疫反应评分。阳性细胞的百分比评分：无染色评分为(-)，计0分；阳性细胞<10%，计1分；10%～50%，计2分；51%～80%，计3分；>80%，计4分。染色强度评分：阴性计0分，低强度阳性染色计1分，中等强度阳性染色计2分，强阳性染色计3分。 染色强度分数加上阳性细胞分数为总分， 0分为阴性染色(-)，2～5分为阳性染色(+)，6分及以上为强阳性(++)。免疫反应评分由2位病理科医师独立完成。

2 结 果

2.1 2组子宫内膜组织中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA表达水平比较 ADS组中在位子宫内膜组织AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA表达水平高于对照组正常子宫内膜(P<0.01)，见表1。

2.2 2组子宫内膜组织中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表达比较 ADS组中在位子宫内膜组织AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表达水平高于对照组正常子宫内膜(P<0.01)，见表2。

2.3 2组子宫内膜组织中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 蛋白表达阳性率比较 ADS组中在位子宫内膜组织AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 蛋白表达阳性率高于对照组正常子宫内膜(P<0.01)，见表3、图1(见封3)。

表3 2组子宫内膜组织中AQP1、AQP2、AQP5、 AQP8 蛋白表达阳性率比较 [例(%)]

2.4 2组AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白在不同月经周期中的表达水平比较 对照组分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表达水平高于增殖期(P<0.01)；ADS组增殖期、分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表达水平无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；ADS组增殖期、分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表达水平均明显高于对照组增殖期、分泌期相应蛋白表达水平(P<0.05)，见表4。

3 讨 论

子宫腺肌病是指子宫内膜腺体和间质在子宫肌层弥漫性或局限性生长，致子宫肌层细胞增生肥大。它是一种妇科常见疾病，好发于30～50岁育龄妇女，发病率在不同人群有一定差异，不同流行病学研究统计出的患病率为8%～62%[10]。主要临床表现有不同程度的继发性进行性痛经和异常子宫出血，可能导致不孕和早期流产等，严重影响女性的身心健康和生活质量。随着医学技术的发展，超声和磁共振检查子宫内膜腺肌病的敏感度和特异度均有提高，但目前仍缺乏子宫腺肌病早期诊断的有效方法[11]。近年来，许多学者对该病的发病机制进行了深入研究，但子宫腺肌病的病因及发病机制仍不清楚。

表1 2组子宫内膜组织中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA表达水平比较

表2 2组子宫内膜组织中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表达评分比较分)

表4 2组AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白在不同月经周期中的表达水平比较分)

研究表明AQP蛋白家族可能参与ADS的病理过程。AQP蛋白是神经营养因子，它具有2种受体，高亲和力酪氨酸激酶受体(TRK)A和低亲和力p75神经营养素受体(p75NTR)。作为一种多功能神经免疫调节剂，AQP蛋白在疼痛、神经可塑性、免疫细胞聚集中有重要调节作用[12]。在ADS中，AQP蛋白可诱导肥大细胞脱颗粒炎性因子的释放，进而导致疼痛。研究表明AQP蛋白在子宫内膜异位症和ADS中异常表达，AQP蛋白参与神经支配和疼痛发生过程。子宫内膜基质细胞可分泌AQP蛋白，并且AQP蛋白通过p75NTR结合发挥其对子宫内膜基质细胞的作用。P75NTR属于TNF/FasCD40受体超家族，可通过NF-κB和神经酰胺信号转导途径与其他神经营养因子及其受体结合，影响细胞生长和凋亡[13-14]。小鼠动物试验发现ADS病灶的胚胎干细胞可以分泌更多的AQP2、AQP5蛋白，其随着ADS疾病严重程度逐渐增加，AQP2、AQP5蛋白水平逐渐升高。作为一种雌激素依赖性疾病，ADS可以通过抑制卵巢功能或雌激素拮抗作用来治疗[15-16]。子宫内膜异位症和正常女性外周血的雌激素水平无显著差异。然而，在ADS患者中观察到月经血中雌激素水平最高，而在正常女性中观察到雌激素水平最低。在ADS或子宫内膜异位症病变中发现高水平的芳香酶(雌激素合成的关键酶)，表明异位子宫内膜保留其营养功能。局部分泌的雌激素不仅可以支持异位子宫内膜灶的生长和侵袭，还可以促进受雌激素调节的细胞因子的表达。AQP蛋白受到雌激素的调节，研究表明卵巢切除的成年雌性小鼠子宫内AQP蛋白明显低于对照组[17-18]。在雌激素替代后，AQP蛋白和mRNA水平增加至卵巢切除术前的水平。雌激素周期或外源性雌激素可增加仓鼠子宫中AQP蛋白的表达。研究还发现，17b-雌二醇促进ADS胚胎干细胞分泌AQP蛋白，其水平相应增加。因此，ADS病变中雌激素分泌增加和对雌激素相对高的敏感性可能是AQP蛋白高表达的原因。本研究结果显示，ADS组中子宫内膜组织AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA及蛋白表达水平高于对照组，这与上述报道相符合，同时提示，子宫腺肌病患者子宫内膜中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8表达水平升高，其参与了子宫腺肌病病理过程。本研究同时发现，对照组分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表达水平高于增殖期(P<0.01)，ADS组增殖期、分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。这说明AQP1、AQP2、AQP5、AQP8在子宫腺肌病患者子宫内膜表达失去月经周期性，这可能是导致子宫腺肌病的原因。

综上所述，子宫腺肌病患者子宫内膜中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8表达水平升高，其参与了子宫腺肌病病理过程；AQP1、AQP2、AQP5、AQP8在子宫腺肌病患者子宫内膜表达失去月经周期性，这可能是子宫腺肌病的原因之一。

利益冲突：无

作者贡献声明

贾利平：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写及修改；王炳淑：质量控制、免疫检测；刘玉珠：课题指导；周小飞、王发辉：病例收集