低钾状态下泮托拉唑致小鼠缓慢型心律失常

李 帅，朱文根，阎 霞，赖 玮，俞建华，万 蓉，洪 葵,,3*

(南昌大学 第二附属医院 1.心血管内科；2.江西省分子医学重点实验室；3.医学遗传专科，江西 南昌 330006)

质子泵抑制剂(proton pump inhibitor, PPI)是一类抑制胃内H+/K+-ATP酶的抑酸药物。目前, 常用的有奥美拉唑(omeprazole)、泮托拉唑(pantoprazole)、兰索拉唑(lansoprazole)、雷贝拉唑(rabeprazole)和埃索美拉唑(esmeprazole)。PPI类药物副作用小，但长期和大剂量使用可引起诸多不良反应，严重者可危及生命[1]。急性冠脉综合征和经皮冠状动脉介入治疗患者在双联抗血小板(阿司匹林和氯吡格雷)治疗时常常接受PPI以预防消化道出血。但氯吡格雷联合使用PPI治疗的患者，可出现更高的心血管事件(如卒中、心肌梗死、心律失常及心血管死亡)[2]。也有报道一般人群长期使用PPI也具有较高的心血管风险[3]。泮托拉唑可能导致心律失常的发生[4-5]，但缺乏动物实验的验证。低钾血症可导致自律性心脏细胞兴奋性和传导性异常，诱导多种心律失常[6]。本研究旨在观察低钾状态使用泮托拉唑致小鼠心律失常及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级雄性C57BL/6J小鼠80只，体质量18～25 g[湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号SCXK(湘)2016-0002]。

1.1.2 主要试剂和引物：泮托拉唑钠(pantoprazole, PPZ)和呋塞米(furosemide, FS)(Sigma-Aldrich公司)；PCR反转录试剂盒和SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(TaKaRa公司)；蛋白检测抗体包括一抗超级化激活核苷酸门控阳离子通道2和4(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels,HCN2和HCN4)、Nav1.5、Cav1.2和Cav3.1(Alomone Labs公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)和山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(北京全式金生物公司)。荧光定量 PCR 检测目的基因所需引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组和处理：将小鼠随机分为对照组：给予等量0.9%氯化钠溶液；PPZ组：泮托拉唑20 mg/(kg·d)连续腹腔注射5周；低钾泮托拉唑组(FS+PPZ组)和低钾组(FS组)分别在泮托拉唑和0.9%氯化钠溶液连续处理第4周末同时给予呋塞米[FS 30 mg/(kg·d)]连续腹腔注射1周，以构建低钾血症模型，每组n=20只。

1.2.2 小鼠心电图和心脏超声检测：采用异氟烷麻醉剂(1% v/v)吸入式麻醉, 将小鼠植入式生理信号遥测系统(TA10-ETA-F10植入子)埋植于小鼠右侧胸肌和左侧上腹皮下，术后恢复3～5 d，进行心电图记录，每只小鼠记录30～60 min，重复3次。观察小鼠心律失常发生情况，采用Dataquest ART 4.0系统分析相关心电参数[心率(heart rate，HR)、PR间期(PR interval，PR)、QRS间期(QRS interval，QRS)及QTc间期(QTc interval，QTc)]。通过vevo2100小动物高分辨率超声影像系统评价各组小鼠的心脏结构及心功能，测定收缩末/舒张末左室内径(LVIDs/d)、室间隔厚度(IVS)、左心室后壁收缩厚度(LVPW)、左室射血分数(EF%)和左室短轴缩短率(FS%)。连续测量3个心动周期并取平均值。

1.2.3 血清电解质检测：取麻醉小鼠下腔静脉血，用自动生化分析仪(Beckman AU5800)测定血清中K+、Ca2+和Mg2+含量。

1.2.4 mRNA和相关蛋白检测：取小鼠左右心房及周围结缔组织，用实时荧光定量PCR和Western blot检测目的基因的mRNA和相关蛋白的表达。所用引物序列如下：HCN2上游引物：5′-TCGGATGGCTC CTATTTC-3′,下游引物：5′-TTCCTCCAGCACCTCG TT-3′;HCN4上游引物：5′-CGGACACCGCTATCAA AG-3′,下游引物：5′-CATCGTCAGGTCCCAGTAAA-3′;GAPDH上游引物：5′-TGTTTCCTCGTCCCGTAG-3′,下游引物：5′-CAATCTCCACTTTGCCACT-3′。反应条件为：95 ℃ 15 s → 60 ℃ 30 s → 95 ℃ 15 s，40个循环。用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量，使用Image Lab软件分析条带吸光度值，每个反应或样本重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 低钾模型小鼠血K+变化及PPZ对各组小鼠电解质的影响

FS组较对照组，FS+PPZ组较PPZ组小鼠血K+含量均降低(P<0.01)，提示造模成功(表1)。在基础和低钾状态下，PPZ组较各自对照组的血K+、Ca2+和Mg2+无明显变化。

2.2 PPZ对小鼠心电图及超声心动图的影响

与对照组比较，PPZ组小鼠HR降低(P<0.01)和PR间期延长(P<0.05)；与FS组比较，FS+PPZ组小鼠HR和PR间期均进一步降低和延长(P<0.01和P<0.05)，有4只小鼠出现窦性停搏(sinus arrest，SA)(P<0.05)(表2)。

表1 各组小鼠血清电解质的比较

*P<0.01 compared with control group;#P<0.01 compared with PPZ group; PPZ.pantoprazole; FS.furosemide.

在基础和低钾状态下，PPZ组较各自对照组的心脏结构和功能参数无明显变化。

2.3 PPZ对小鼠心房HCN2、HCN4 mRNA和蛋白表达的影响

PPZ组较对照组小鼠心房HCN2和HCN4 mRNA表达水平均下降(P<0.05，P<0.01)，HCN4蛋白水平表达下降(P<0.01)；FS+PPZ组较FS组的HCN2、HCN4 mRNA和HCN4蛋白进一步降低(P<0.01)(图1，2)。

表2 各组小鼠心电图参数和窦性停搏发生率的比较

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.05,##P<0.01 compared with FS group; PPZ.pantoprazole; FS.furosemide.

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group; #P<0.01 compared with FS group; PPZ.pantoprazole;FS.furosemide; base.baseline

*P<0.01 compared with control group; #P<0.01 compared with FS group; PPZ.pantoprazole; FS.furosemide;Base.baseline

3 讨论

本研究观察到泮托拉唑可导致缓慢型心律失常。已知HCN2、HCN4、SCN5A、CACNA1C及CACNA1G等基因编码的心脏离子通道对心脏节律有重要影响[7-9]。本研究还发现泮托拉唑所致HCN2及HCN4表达障碍可能导致缓慢型心律失常。

HCN有4种亚型(HCN1-4)，其中HCN4在窦房结高表达，HCN2表达较少，由其介导的起搏离子流If是一种超级化激活的内向离子流，主要对Na+和K+通透，可限制窦房结起搏细胞的过度超极化并影响窦房结细胞舒张期自动除极化，具有调控起搏和心率的作用[10]。HCN2和HCN4可被细胞内的pH值调节，从而阻滞通道的激活[11]。H+/K+-ATP酶可能参与调节心肌细胞内pH值和K+浓度[12]。提示PPI可能通过抑制心肌H+/K+-ATP酶而影响心肌细胞内pH值，调控HCN2和HCN4通道的活性和表达，导致HCN2和HCN4功能障碍而减慢心率和延长PR间期。

本文还发现FS组心率较慢，PPZ合并FS可出现窦性停搏。已知低钾引起的心肌细胞内pH值降低对HCN4通道具有调节作用。血K+浓度持续过低可导致电流幅度显著降低，影响HCN通道的活化[13-14]，延缓传导和减慢心率。这可能是PPZ合并低钾更明显减慢心率及更易诱发缓慢型心律失常的原因。

兰索拉唑显著延长大鼠离体心房肌细胞动作电位持续时间，主要与K+电流抑制有关，动作电位持续时间的延长也是通过增加心动周期时间来降低心率的原因[15]。本研究中PPI可能通过改变心肌细胞的电生理特性而导致体表心电图变化甚至临床上发生心律失常。

本结果提示，长期使用PPI的患者应该注意心率减慢和PR间期的延长；若同时服用其他减慢心率或可能导致电解质紊乱的药物，需要严密注意心律失常的发生风险。进一步需观察PPI对窦房结细胞的具体电生理机制，为药源性缓慢型心律失常的治疗提供新的依据。