胰腺细胞的再生方法及相关机制

姜爱君 彭爽 李倩

南京医科大学附属南京医院内分泌科 210006

近年来，胰腺疾病患者逐年增加，许多研究都集中在胰腺细胞再生性治疗领域。胰腺的外分泌组织由分泌消化液的腺泡细胞和导管系统构成，内分泌组织是由许多胰岛组成，这些胰岛包括多种不同的细胞类型，至少分泌5种不同的激素进入血液循环(α细胞分泌胰高血糖素；β细胞分泌胰岛素；δ细胞分泌生长抑素；ε细胞分泌生长激素；γ或PP细胞分泌胰多肽)。胰腺炎和胰腺癌大部分病源于外分泌胰腺，而糖尿病是病源于内分泌胰岛，胰腺内、外分泌细胞的再生可补充细胞数量、恢复细胞功能、延缓或治愈疾病，本文就胰腺细胞再生方法及相关机制展开综述。

1 外分泌胰腺再生

外分泌胰腺表现出较强的再生和更新能力。在实验模型系统中外分泌组织的部分丢失，如急性胰腺炎或部分胰腺切除术，可通过扩大存活的腺泡细胞，诱导快速恢复。多种物质可以影响腺泡细胞再生，例如肥胖抑制素、金盏花提取物及雷马酚[1]可以促进小鼠腺泡细胞分裂，有助于腺泡再生，而吗啡[2]、布洛芬[3]及高甘油三酯血症[4]会抑制急性胰腺炎腺泡的再生与恢复。另外，机体本身也有促进腺泡细胞再生的因子如肝再生增强因子ALR[5]，其通过抑制高迁移率族蛋白B1/Toll样受体4/核因子-κB信号通路，减轻急性胰腺炎;细胞外基质分子POSTN是重症急性胰腺炎后由活化的胰腺星状细胞分泌的外分泌谱系特异性再生的关键因子。Chan等[6]研究发现，在Caerulein诱导的胰腺炎小鼠模型中核因子-κB必需调节剂(NEMO)的缺失，可导致急性胰腺炎的炎性反应轻微变化，但在慢性胰腺炎中，其缺失会加重胰腺炎性反应和纤维化，抑制代偿性腺泡细胞增殖，增强腺泡萎缩和引起腺泡导管化生，说明NEMO通过限制炎性反应和纤维化以及促进腺泡细胞再生，在慢性胰腺炎中发挥保护作用。同时，Das等[7]研究发现，胰腺损伤后再生过程中还会发生腺泡-导管上皮化生(ADM)，转录因子Ets差异基因5(Ets variant gene 5, Etv5)是导管细胞特征性因子和ADM的关键调节因子，Etv5的缺失会导致ADM形成受损，胰腺炎的严重程度增加，进一步研究表明ADM有助于组织再生和损伤恢复。此外，Nicole等[8]使用凋亡蛋白-8和白喉毒素基因敲除斑马鱼腺泡细胞，发现ptf1a+、ela3l-细胞(一种新型胰腺前体细胞)可以分化为外分泌细胞并通过随后的Wnt信号依赖性增殖，恢复外分泌细胞团,这意味着腺泡细胞再生还可能源于胰腺干/祖细胞。

虽然急性胰腺炎患者可以完全恢复，但目前还不清楚他们的外分泌胰腺是否经历了类似于动物模型的自发修复和再生；在慢性胰腺炎中，ADM有助于胰腺炎腺泡细胞的再生，但是也可能导致胰腺纤维化和恶性肿瘤的发生，其机制尚未完全明确，这也许是慢性胰腺炎容易发展成为胰腺癌的一个原因。

2 内分泌胰腺再生

数十年的临床研究已经证实，胰岛移植对糖尿病部分患者是有益的，他们可在数年内不注射胰岛素或口服降糖药物，而血糖仍然保持在合适的范围[9]。然而，由于缺乏合适的供体胰岛，并且需要长期的免疫抑制来对抗自身和同种异体免疫，临床胰岛移植仅在小范围内使用。为了治疗更多的患者，刺激内源性胰岛再生已成为研究者们感兴趣的话题，包括促进β细胞增殖，或非β细胞转分化。

2.1 β细胞增殖 在机体妊娠期间、肥胖时或在胰岛素抵抗条件下可以观察到β细胞增殖增加。例如，小鼠胰岛β细胞数量在妊娠期间增加3～5倍，其中主要受催乳素的刺激作用所致；另外，视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)也对β细胞的增殖和功能具有重要调节作用[10]。 Zhao等[11]用胰腺特异性Rb基因敲除(RB-KO)小鼠与野生型小鼠对照研究，结果表明，随着Rb基因的敲除，催乳素不会导致细胞周期进程的进一步增加，证实催乳素在妊娠期间是通过信号转导与转录激活子5-细胞周期蛋白D/周期蛋白依赖性激酶4途径使得Rb磷酸化，从而促进β细胞增殖增加。高脂饮食诱导的小鼠肥胖易引起胰岛素抵抗，β细胞发生代偿性增殖，产生更多的胰岛素以降低血糖[12]。蛋白激酶Cζ可调节下游信号号哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和细胞周期蛋白D2，这在因饮食诱导的胰岛素抵抗中早期，β细胞代偿性增殖中至关重要[13]。然而在生理状态下，β细胞增殖能力与年龄有关，有丝分裂能力在出生时最高，随着年龄增长增殖能力逐渐降低，到成年时急剧下降，甚至不复存在。因此，探讨成人β细胞增殖的相关分子机制以提高其增殖能力是糖尿病治疗的理想目标。

药物如Harmine[14]、CC-401[15]或氨基吡嗪[16]等可抑制人体胰岛β细胞中双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)，它可使活化T细胞核因子(NFAT)发生磷酸化，NFAT通常以磷酸化状态定位于细胞质中，但当DYRK1A被抑制时，NFAT磷酸化水平降低并移位到细胞核以促进β细胞有丝分裂，然而完全抑制DYRK1A则不会引起β细胞的明显增殖[17]。转化生长因子-β(TGF-β)途径通过激活Smad影响β细胞增殖。Wang等[14]应用TGF-β超家族(TGFbSF)受体抑制剂阻止Smad蛋白的活化，通过DYRK1A和TGF-β的联合抑制，观察到人体β细胞增殖进一步增加。Dai等[18]在幼年胰岛中用exendin-4，即一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，诱导钙调神经磷酸酶/NFAT信号成分的表达以及增殖促进因子的靶基因(如NFATC1、FOXM1和CCNA1)，发现能够刺激青少年而不是成人胰岛β细胞增殖。此外，叉头盒转录因子1还参与了雌二醇-17β介导的人胰岛的增殖。另有研究表明，中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)可保护人类β细胞免受实验诱导的内质网应激，从而减少β细胞凋亡和促进增殖，当TGF-β信号转导受到抑制时，MANF可使原代人β细胞的增殖倍增，MANF的保护作用还与抑制核因子-κB信号通路有关[19]。不同类型胰岛细胞之间的相互影响也可调节胰岛功能，胰岛δ细胞分泌的生长抑素可缓解低糖水平所致的细胞应激标志物(Hspa1a和Ddit3)的上调和β细胞凋亡，而细胞周期抑制剂p57已被证明可以诱导人β细胞的细胞凋亡[20-21]。

2.2 非β细胞转分化 转分化一般指通过具有双表型或去分化步骤的中间体，将一种已分化的细胞类型转化为另一种成熟类型的细胞。转录因子的异位表达可以通过体细胞转分化，将终末分化的细胞转化为产生胰岛素的细胞。研究表明，参与胰岛β细胞分化的重要转录因子包括胰-十二指肠同源盒蛋白1(Pdx1)、神经元素3(Ngn3)、 配对盒基因4(Pax4)、V-maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(Mafa)、NK2转录因子相关蛋白2(Nkx2.2)以及NK6转录因子相关蛋白1(Nkx6.1)等，这些蛋白协调表达决定了非β细胞的转分化。

2.2.1 α细胞 作为胰腺内分泌细胞，α细胞与β细胞有着相似的表观遗传学特征，均位于胰岛内且位置相近。基于这些优势，大量研究证实，在α细胞中过表达关键的β细胞转录因子可以触发它们转分化以产生β样细胞。Furuyama等[22]将已故糖尿病患者α细胞移植到糖尿病小鼠中，用转录因子Pdx1和Mafa跟踪并重编码，发现移植的人α细胞可产生胰岛素长达6个月之久以逆转糖尿病。用表达GLP-1的重组腺病毒(Rad-GLP-1)和exendin-4处理小鼠α细胞，发现胰岛素(+)胰高血糖素(+)双阳性细胞显著增加，且exendin-4促进了胰岛中成纤维细胞生长因子21(FGF21)的表达和分泌；与野生型小鼠相比，FGF21基因敲除小鼠通过Rad-GLP-1处理产生的胰岛素分泌细胞显著减少，说明GLP-1在α细胞转分化产生新的β细胞中具有重要作用，且可能是通过FGF21介导[23]。在链脲佐菌素诱导的糖尿病和非肥胖糖尿病小鼠模型中，应用胰高血糖素受体单克隆抗体(GCGR mAb)治疗可增加活性GLP-1水平，进而诱导α细胞向β细胞的转化，提示GLP-1还受到GCGR mAb的调节以诱导α细胞向β细胞转化[24]。γ-氨基丁酸信号可以促进该转分化的过程。但是α细胞转分化导致自身数量减少，从而使循环血中的胰高血糖素水平降低，是否会增加低血糖事件发生的风险，这又是一个值得探究的问题。

2.2.2 δ细胞 α细胞转分化往往发生在从青春期到成年期，甚至可以发生在老年期，而δ细胞转分化往往发生在幼年期，Chera等[25]用白喉毒素将99%的β细胞破坏，4个月后β细胞的数量增加了45倍，与胰岛细胞增殖高峰一致的是，幼鼠中δ细胞数量相应减少，从而证明产生生长抑素的δ细胞能够自发的集体转分化。幼体表现出生长抑素-胰岛素δ细胞转化，涉及去分化、增殖和胰岛发育调节因子的重新表达。

因此，非β细胞起源的胰岛素产生细胞的恢复，能够通过α细胞或δ细胞自发转分化贯穿整个生命过程。多个胰岛内细胞相互转换事件的出现，为糖尿病的治疗提供了新视角。

2.2.3 腺泡及导管细胞 在关键转录因子Ngn3、Pdx1和Mafa的异位表达下，外分泌胰腺也可以产生内分泌胰岛素分泌细胞。但是，转分化的成功不仅取决于转录因子的传递，还取决于其他环境，例如Cavelti-Weder等[26]用链脲佐菌素诱导β细胞消融后，创建不同血糖水平的小鼠模型，然后通过病毒传递编码转录因子的基因至外分泌胰腺，观察到高血糖能显著减少腺泡细胞转分化为胰岛素产生细胞；然而另一成年小鼠研究发现，高血糖(>300 mg/dl)是诱导胰腺导管细胞分化为分泌胰岛素的β细胞所必需的，揭示血糖水平是糖尿病模型中转分化成功的重要条件[27]。除了血糖，温度对外分泌胰腺细胞转分化也至关重要。研究表明，腺泡细胞在常温(37℃)下培养可迅速失去表型并自发转分化为导管样表型，而在低温(4℃)下培养则容易转分化为胰岛β样细胞[28]。此外，成人胰腺腺泡及导管细胞通过暴露于骨形态发生蛋白-7而转化为内分泌细胞，体外谱系追踪证实骨形态发生蛋白-7诱导的胰岛素表达细胞主要来源于表达Pdx1的胰岛外细胞、表达碳酸酐酶Ⅱ的成熟导管细胞和表达弹性蛋白酶3a的腺泡细胞，这种非遗传转化方式更新颖、更安全、更简单[29]。

2.2.4 其他消化腺细胞 胃肠细胞及肝细胞是胰岛素分泌细胞的可行内源性来源，可能是因为这两种细胞类型都来自原始的前肠内胚层，有着共同的早期发育阶段。传统方法用携带Pdx1、Mafa和beta2/neurod基因的腺病毒载体感染小肠上皮细胞，4周后发现小肠内有胰岛素mRNA表达[30]。且另一个独立研究表明，GLP-1可以促进肠上皮细胞的胰岛素表达[31]。将携带Pdx1、Neurog3和Mafa基因的质粒导入小鼠肝细胞，从蛋白质和mRNA水平研究转染细胞中的胰岛β细胞标志物，观察糖尿病小鼠血糖的长期控制情况，可发现肝细胞能够直接重新编程为胰岛素分泌细胞，并且空腹血糖水平降至正常，并持续到转染后100 d，有望解决传统的病毒转染带来的潜在安全性问题。同时，最近研究提示，将间充质干细胞和内皮祖细胞构建胰腺血管生态位后，将二者与肝细胞产生的胰岛素分泌细胞共同植入体内，细胞存活率增加了一倍，胰岛素产量增加了3倍,说明血管系统对胰岛素分泌细胞的成熟和植入后的存活表现出旁分泌效应。体内生态位的重建有望促进肝脏到胰腺的转分化，且这种细胞治疗方法具有临床应用价值[32]。

成人胰腺外组织的转化，克服了来自供体的组织可获得性不足和抗排斥治疗的问题，且转化的安全优势在于，这个表观遗传过程不涉及外源DNA插入、多能诱导，或不受控制的细胞增殖。

即使这些转分化细胞可以产生胰岛素，但是目前研究表明，其不具备β细胞的形态、分子和功能特性，只能称之为β样细胞或胰岛素分泌细胞，并且大多数研究都还只是基于对啮齿类动物的观察和在人体细胞中进行的体外概念验证实验。在人体内诱导非β细胞转分化过程，最终增加β细胞数量和质量，仍是一个重大挑战。

综上所述，胰腺再生性治疗的进展与挑战并存。胰腺腺泡细胞拥有自我再生能力，但临床上重症急性胰腺炎患者死亡率高，即使幸存的患者也会遗留不同程度的胰腺功能不全，甚至演变成为慢性胰腺炎，这就对腺泡细胞的再生速度与程度有了更高的要求，因此进一步研究其再生机制至关重要；胰岛β细胞可以通过各种途径使非β细胞转分化实现再生，或者通过不同的生物因子激活或抑制相关信号通路来增强β细胞的增殖，这些与糖尿病密切相关。目前对于胰岛β细胞再生的研究已经取得的这些成就，尚不足以应对糖尿病发病的速度，且现阶段这些研究对象仅仅限于啮齿类动物、斑马鱼或体外细胞，与人体内再生方式是否相同？再生的β样细胞是否能够产生足够的胰岛素？这些胰岛素对血糖的反应是否正常？在此过程中是否会带来其他严重的不良反应？以及体外移植如何克服免疫排斥与致瘤问题？相信随着研究的深入，胰腺细胞再生性治疗将会为胰腺疾病患者带来新希望。