响应面优化红香木树皮浸泡酒抗氧化活性以及成分分析

张言，高定烽，李思敏，石峰，熊华斌，2，3，*，高云涛，李晓芬，杨志

（1.云南民族大学化学与环境学院，云南昆明650500；2.云南省跨境民族地区生物质资源清洁利用国际联合研究中心，云南昆明650500；3.民族地区矿产资源综合利用重点实验室，云南昆明650500）

红香树（Anneslea fragrans Wall）为山茶科茶梨属常绿乔木，又名猪头果[1]、红楣和香叶树[2]。红香树生命力极强，在云南普洱思茅等地的山坡路旁以及杂草从中都可以找到红香树。红香木树皮研磨成粉末食用可以达到健胃、舒肝、退热；其树皮直接煮水食用可以治消化不良、肠炎、肝炎[3]。随着生活水平的提高，人们对功能食品越来越关注。开始出现利用功能植物的浸泡酒，如玛咖浸泡酒[4]、鱼腥草泡酒[5]等。但红香木树皮浸泡酒还缺乏系统报道。

本试验分别利用紫外分光光度计（ultraviolet spectrophotometer，UV） 和气相色谱与质谱联用（gas chromatography coupled with mass spectrometry，GC-MS）对红香木树皮浸泡酒的成分以及抗氧化活性进行分析，为进一步开发和利用红香木树皮浸泡酒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红香木树皮采自于云南普洱思茅县，分布于低纬高原南亚热带季风气候区，树皮均来自同一棵红香树。在试验中使用的红香树树皮均被粉碎，并且过60目筛子，备用。

95%乙醇（分析纯）、DPPH：美国Sigma 公司；实验室用水为超纯水。

1.2 材料与设备

SJIA-2012 超声波细胞破碎机：宁波双嘉仪器有限公司；8453 型紫外可见分光光度计：美国安捷伦公司；FA2004 电子分析天平：上海上平仪器公司；HH-4 水浴锅：力辰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 红香木树皮提取物最大吸收峰的测定

准确称取3.0 g 红香木树皮干粉，按液固比10 ∶1（mL/g）加入乙醇，置于 60 ℃水浴中萃取 2 h，以4 000 r/min 离心10 min，取上清液，备测。备测样品均用对应溶剂稀释50 倍，再进行200 nm～800 nm 的光谱扫描，得到红香木树皮溶液的吸收光谱和最大吸收峰。

1.3.2 不同体积的乙醇的浸泡物对DPPH 自由基的清除效果

准确称取3.0g 红香木树皮干粉共6 份，分置于6个200 mL 烧杯中，以保鲜膜封口，按液固比 10 ∶1（mL/g）分别加入体积分数为0%、10%、30%、50%、70 %和95%的乙醇开展试验，均置于50 ℃水浴中浸提2 h，然后取滤液离心。取10 mL 配置好的DPPH（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入0.5 mL 的滤液，测定其吸光度，并计算溶液对DPPH 自由基的清除率。

1.3.3 不同料液比的红香木树皮溶液对DPPH 自由基的清除效果

准确称取3.0g 红香木树皮干粉共6 份，分置于6个200 mL 烧杯中，以保鲜膜封口，按液固比 5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）加入乙醇开展试验，均置于50 ℃水浴中浸提2 h，然后取滤液离心。取10mL配置好的DPPH 自由基（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入0.5 mL 的滤液，测定其吸光度，并计算溶液对DPPH 自由基的清除率。

1.3.4 不同超声功率的红香木树皮溶液对DPPH 自由基的清除效果

精确称取3.0 g 红香木树皮干粉共6 份，置于6 个200mL 烧杯中，以保鲜膜封口并置液固比为10∶1（mL/g）、50 ℃水浴中浸提2 h，然后取出各烧杯，设置超声时间为 20 min，分别超声提取 150、225、300、375、450、525 W，然后取滤液离心。取10 mL 配置好的DPPH 自由基（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入 0.5 mL 的滤液，测定其吸光度，并计算溶液对DPPH 自由基的清除率。

1.3.5 不同超声时间的红香木树皮溶液对DPPH 自由基的清除效果

准确称取6 份3 g 红香木树皮干粉，置于200 mL 烧杯中，将瓶口以保鲜膜封口并置液固比为10 ∶1（mL/g）、60 ℃水浴中浸提2 h，然后取出各烧杯，设置超声功率为 200 W，分别超声提取 5、10、20、30、40、50、60 min，然后取滤液离心。取10 mL 配置好的DPPH 自由基（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入 0.5 mL 的滤液，测定其吸光度，并计算溶液对DPPH 自由基的清除率。

1.3.6 中心复合试验设计（central composite design，CCD）设计及其试验结果

在探究对DPPH 自由基清除的过程中，适当超声的引入有利于提高乙醇对红香木树皮有效物质的浸出，从而使清除率增加，但大功率的超声的使用则产生反作用，由此可见，超声功率是构建红香木树皮乙醇浸出物对DPPH 自由基清除的关键性因素，故选取超声功率作为响应面分析的影响因素。此外，在单因素试验中，一定范围内的液固比和超声时间对清除率的影响较为显著，故将其作为响应面分析的影响因素。因此，采用Expert 8.1.6 软件中的CCD 法对清除体系中液固比、超声时间和超声功率对DPPH 自由基清除率的影响进行探究。根据CCD 设计原理，液固比、超声时间和超声功率各设置3 个水平，因素水平表见表1。

表1 响应面优化超声辅助清除DPPH 自由基试验的因素与水平值Table 1 Response surface optimization of ultrasound-assisted removal of DPPH free radical test factors and levels

1.3.7 红香木树皮泡酒的抗氧化活性分析

准确称取3 g 红香木树皮干粉，置于200 mL 烧杯中，加入30 mL 的色谱级乙醇，在60 ℃水浴中浸提2 h，待测；取 10 mL 配置好的 DPPH 自由基（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入0.5 mL 的滤液，待测。

2 结果与分析

2.1 红香木树皮提取物最大吸收峰的测定

红香木树皮和DPPH 自由基的紫外谱图见图1。

图1 红香木树皮和DPPH 自由基的紫外谱图Fig.1 UV spectrum of Anneslea fragrans Wall.bark and DPPH free radical

由图1 可知，红香木树皮溶液的吸收光谱在400 nm～800 nm 之间并没有吸收峰，DPPH 溶液在 328、517 nm 处出现2 个较强的特征吸收峰，而红香木树皮溶液在218 nm 处出现较强的特征吸收峰。所以本试验选用的红香木树皮溶液的最大吸收波长为218 nm。

不同提取温度的红香木树皮溶液对DPPH 自由基的清除率见图2。

由图2 可知，温度在提取过程中可以分为2 个阶段，一是加速提取；二是缓慢提取。在45 ℃～50 ℃之间的红香木树皮树皮的溶液对DPPH 自由基清除率的影响随温度的升高而升高，但从50 ℃～65 ℃之间的红香木树皮的溶液，随着温度的升高清除率缓慢增加，其原因可能是因为在提取过程中温度慢慢接近于乙醇的沸点温度78 ℃[6]，一部分乙醇蒸发；还可能是从红香木树皮提取出来的物质具有热敏性，温度过高导致一些热敏性成分损失[7]，所以在提取过程中所用温度均为 50 ℃。

图2 不同提取温度的红香木树皮溶液对DPPH 自由基的清除Fig.2 Removal of DPPH free radicals by Anneslea fragrans Wall.bark solution at different extraction temperatures

不同体积分数的乙醇浸泡液对DPPH 自由基的清除率见图3。

图3 不同体积分数的乙醇浸泡液对DPPH 自由基的清除率Fig.3 Removal of DPPH free radicals by different volume fractions of ethanol soaking solution

由图3 可知，在不同体积的乙醇浸泡液试验中可以看出0%～50%体积分数的乙醇对DPPH 自由基的清除效果呈明显上升的趋势。当乙醇体积分数达到了50%时，红香木树皮提取物清除DPPH 自由基的效果达到了最大，当乙醇体积分数达到了95 %时，对DPPH 自由基的清除效果并没有显著增加。由此可以认为对于红香木树皮提取溶液的选择是极为重要的，对DPPH 自由基有清除效果的物质不单单是醇溶，也不都为水溶。很多文献显示不同溶剂提取物对DPPH自由基清除能力有不同的影响[8-9]。从此试验中可以得出市场上的适度白酒可以最大化的将红香木树皮的有效物质提取出，而且提取过程中单纯使用水溶液提取的液体容易霉变，不便于保存。

2.2 不同液固比的红香木树皮溶液对DPPH自由基的清除效果

不同液固比的红香木树皮溶液对DPPH 自由基的清除率见图4。

图4 不同液固比的红香木树皮溶液对DPPH 自由基的清除Fig.4 Removal of DPPH free radicals by Anneslea fragrans Wall.bark solution with different ratios of material to liquid

由图 4 可知，在液固比 5 ∶1（mL/g）～15 ∶1（mL/g），清除率随液固比呈快速上升趋势，对DPPH 自由基的清除率达到最大值，液固比大于 15 ∶1（mL/g）时，清除率反而随液固比的增加而显著变化，这是由于随着红香木树皮干粉质量增加，溶解也在增加，但是乙醇体积有限，溶解能力有限[10]，无法将红香木树皮干粉全部溶解，故乙醇溶液已经达到饱和状态，所以清除率不再有变化。

2.3 不同超声功率的红香木树皮溶液对DPPH的清除效果

不同超声功率的红香木树皮溶液对DPPH 的清除率见图5。

图5 不同超声功率的红香木树皮溶液对DPPH 的清除率Fig.5 Clearance of DPPH by Anneslea fragrans Wall.bark solution with different ultrasonic power

超声功率为150 W～525 W 时的清除率呈整体下降趋势。相对于超声功率为450 W～525 W，150 W～450 W时的清除率下降较为缓慢。对这种影响超声功率的增加，清除率反而有所下降，这可能是由于超声功率过高，超声波对红香木树皮干粉的组织结构产生了破坏作用[11]，体系中有大量的色素分子，这一部分色素在加入DPPH 自由基的过程中对吸光度有影响，从而造成清除率降低的现象。

2.4 不同超声时间的红香木树皮溶液对DPPH自由基的清除效果

不同超声时间的红香木树皮溶液对DPPH 自由基的清除率见图6。

图6 不同超声时间的红香木树皮溶液对DPPH 自由基的清除率Fig.6 Removal of DPPH free radicals by Anneslea fragrans Wall.bark solution at different ultrasonic times

由图6 可知，在 10 ∶1（mL/g）的液固比，200 W 超声功率的条件下，研究不同的超声时间下对DPPH 自由基清除的影响。在20 min～30 min 时，随着超声时间的延长，清除率呈直线上升趋势；与20 min～30 min 时相比，随着超声时间的延长，30 min～70 min 时提取液的吸光度值较平缓，这可能是由于随着超声时间的延长，溶剂体系的渗透压接近平衡，色素随着溶剂向细胞外缓慢扩散[12]。

2.5 超声辅助提取的响应面法优化

2.5.1 CCD 试验设计及试验结果

据CCD 试验设计，以液固比、超声时间和超声功率3 个因素作为自变量A、B、C，红香木树皮乙醇的浸出物对DPPH 自由基的清除率作为响应值R，通过Expert 8.1.6 分析软件获得的试验方案及其采用该方案获得的试验结果如表2 所示。

表2 CCD 试验设计及试验结果Table 2 CCD test design and experimental results

续表2 CCD 试验设计及试验结果Continue table 2 CCD test design and experimental results

2.5.2 回归和方差分析

以红香木树皮乙醇浸出物对DPPH 自由基清除率为响应值，在响应面分析软件中对液固比、超声时间和超声功率进行回归拟合，响应值R 清除率与各影响因子间的回归方程为：

所得模拟方程具有较好的相关性，相关系数为R2=0.988 4。此外，对回归模型进行了方差分析，结果如表3 所示。

表3 清除DPPH 自由基回归方差分析结果Table 3 Elimination of DPPH free radical regression analysis of variance results

建立模型的P＜0.000 1，具有极显著性，失拟项的P＞0.1，无显著性，由此可见，所建模型可用于清除DPPH 自由基的响应面分析。此外，A、B、C、BC、A2、B2、C2项的P 值均小于0.05，表现出显著性，这表明固液比、超声时间和超声功率均为清除DPPH 自由基过程中影响清除率的主要因素，其中，A、C、C2项的 P＜0.001，即液固比和超声时间对DPPH 自由基的清除率的影响高度显著，而B 的P＜0.05，表明超声功率对DPPH 自由基的清除率的影响效果要明显弱于液固比和超声时间。AB、AC、BC 项中，仅有 BC 的 P＜0.01，这表明超声时间和超声功率对DPPH 自由基的清除率的影响在一定程度上表现出交互作用，而其他因素间则无此效应。

2.5.3 响应面分析

各因素及其交互作用对超声辅助提取影响的响应面见图7。

图7 各因素及其交互作用对超声辅助提取影响的响应面图Fig.7 Response surface diagram of the effects of various factors and their interactions on ultrasound-assisted extraction

图7 显示了液固比（A）、超声功率（B）和超声时间（C）三因素对DPPH 自由基清除率的等高线图a、图c、图 e 和 3D 响应面图 b、图 d、图 f，3D 响应曲面在二维平面上的投影就是等高线图。由图7a 可以看出，沿着B因素（超声功率）向峰值方向移动，其等高线的密度明显低于沿A 因素（液固比）方向，由此可见，相对于超声功率，液固比对DPPH 自由基清除率的影响更为显著。由对应的3D 响应面图7b 也能获取相同的结果，在B因素方向，响应面曲线较为平缓，说明超声功率对DPPH 自由基清除率影响较小，随超声功率的增加，清除效果有增加的趋势，但增加的程度并不大，影响并不十分显著，而沿A 因素方向则出现了较为明显的变化，响应面曲线较陡，液固比引起清除率的变化较大，说明液固比对DPPH 自由基清除率的影响大于超声功率。

图7c 和图7d 则显示了A 因素（液固比）和C 因素（超声时间）对DPPH 自由基清除率的影响。由等高线图可以看出，沿着C 因素（超声时间）向峰值方向移动的等高线密度也要相对低于沿A 因素（液固比）方向。由3D 响应面图则可以看出，在A 因素方向响应面曲线有一定的坡度，但是，在C 因素方向，响应面曲线较为平缓，说明超声时间对DPPH 自由基清除率的影响较小，随超声时间的增加，对DPPH 自由基清除率有增加的趋势，但增加的程度并不大，影响并不十分显著。由此可见，A 因素变化对结果的影响要高于C 因素，即相对于超声时间，液固比的影响更大。

由图7e 和图7f 可以比较B 因素（超声功率）和C因素（超声时间）对DPPH 自由基清除率的影响。由两因素沿峰值方向的等高线密度及其3D 响应面图中响应面曲线的陡峭程度可以看出，B、C 两因素的影响也存在较大差异，相对于超声功率，超声时间的影响较弱一些。响应面分析直观反映了各因素的影响情况，其效果优于单因素试验，综合分析可以发现，3 个因素对清除率的影响有所不同，其程度大小为：液固比＞超声功率＞超声时间。

此外，通过响应面分析模型对DPPH 自由基清除率条件进行了优化分析，预测的最优条件是液固比为20 ∶1（mL/g）、超声时间为 21.65 min、超声功率为232.31 W，预测的最优清除率为95.15%。通过试验检验最优预测条件下的提取效果，清除率与预测值相接近，达到91.6%，相差3.56%。

2.6 红香木树皮泡酒的GC-MS分析

红香木树皮在色谱级的乙醇中浸泡24 h 的气相色谱图见图8，红香木树皮溶液成分分析见表4。

图8 红香木树皮气相色谱图Fig.8 Gas chromatogram of Anneslea fragrans Wall.tree bark

表4 红香木树皮溶液成分分析Table 4 Composition analysis of Anneslea fragrans wall.bark solution

从图8 和表4 中可以看出，从浸泡液中分离出了8 种物质。

本研究采用气相色谱仪对浸泡液清除DPPH 自由基的成分进行了分析，并利用气质色谱联用仪对色谱中出现的各峰进行解析，加入红香木树皮后溶液气相色谱见图9。

图9 加入红香木树皮后溶液气相色谱图Fig.9 Gas chromatogram of the solution after adding Anneslea fragrans Wall.bark

从图9 可知，从中分离出4 种物质。

3 结论

经优化后，红香木树皮浸泡酒预测的最优条件是液固比为 20 ∶1（mL/g）、超声时间为 21.65 min、超声功率为232.31 W，预测的最优去除率为95.15%。通过试验检验最优预测条件下的提取效果，清除率与预测值相接近，达到91.6%，相差3.56%。

红香木树皮浸泡酒因红香木树皮的特有成分，营养丰富，感官指标良好，风格独特，具有进一步开发利用的价值。