不同切割伤害程度对大蒜次生代谢物质合成的影响

王茂瑞

（大连民族大学生命科学学院，生物技术与资源利用-教育部重点实验室，辽宁大连116600）

大蒜（Allium sativum L.）属于单子叶百合科植物，性温，味辛平[1]。大蒜自古就被当作天然杀菌剂，有“天然抗生素”之称。另外，大蒜还有很好的防肿瘤和抗癌症的作用[2]。切割伤害会导致大蒜愈伤呼吸的产生[3]，细胞腔室内蒜氨酸酶释放。在很短的时间内（10 s），蒜氨酸酶即可将蒜氨酸全部转化，生成一种活性中间体次磺酸以及副产物丙酮酸和铵根离子（NH4+）。同时，产生的次磺酸两两结合可生成具有强烈辛辣味的挥发性物质大蒜素[4-6]。大蒜素具有助消化、增强机体免疫力、抗氧化、清除自由基等功能[7-8]。但是大蒜素很不稳定，它会进一步分解产生小分子含硫化合物，如三硫化二丙烯，二硫化二丙烯等，这些小分子即形成了大蒜特有的风味，俗称蒜臭味[9-12]。

现阶段关于大蒜次生代谢物质的研究，大多停留在物理化学因素如超声波[13-14]、超高压[15-16]、冷冻干燥[17-20]、金属离子[21]以及发酵处理[22-24]等的作用下，大蒜颜色、风味物质、蒜氨酸酶活力、大蒜素含量、抗氧化能力等次生代谢物质合成的变化，但是对于大蒜所受最普遍的切割伤害以及切割伤害程度的大小与不同贮藏温度、不同贮藏时间的影响条件下大蒜次生代谢时的呼吸强度、蒜氨酸酶活力以及风味物质等研究还未见报道。因此，本研究将从大蒜的切割伤害程度着手，从大蒜受到切割伤害时开始，研究伤害后呼吸强度变化、大蒜素合成前体蒜氨酸酶活力变化以及大蒜素合成后分解出的各类挥发性成分变化，旨在为大蒜切割伤害后贮藏与相关次生代谢物质合成研究提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大蒜：市购。

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、氢氧化钠、无水乙醇、正己烷、二烯丙基二硫醚标准品[大蒜素、二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS），纯度≥90 %]、三氯乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸吡哆醛、2，4-二硝基苯肼（以上试剂皆为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；蒜氨酸（色谱纯，纯度≥98%）：上海士锋生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-2010 型气相色谱仪、GCMS-QP2010 Plus 型气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；SPS401F 型分析天平：梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；DK－S26 型电热恒温水浴锅、SHY-2A 型恒温水浴振荡器：上海精宏实验设备有限公司；JJ-2 型组织捣碎机：江苏无锡沃信仪器有限公司；TGL-20M 型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；UV-2600 型紫外分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同切割伤害程度的大蒜样品处理

将挑选的新鲜大蒜去皮，制成4 种不同切割伤害程度的大蒜样品。整蒜为仅脱去蒜皮不作切割伤害的大蒜，即正常进行生命活动的大蒜样品，可作为对照；蒜片为将整蒜沿蒜瓣根部到芽部的基线切割（保持每片蒜片具最大横截面积），均匀切割成厚度为2 mm 左右的片状样品；蒜末为将上述蒜片切割为直径不超过1 mm 的块状样品；蒜泥为将上述蒜末经研钵研磨，并过20 目筛，制成泥状样品。

1.3.2 气相色谱法测定大蒜呼吸强度

分别取整蒜、蒜片、蒜末、蒜泥样品各分装6 个500 mL 顶空样品盒，每盒50 g，保持顶空盒中样品上方留有一半以上的空间，并于5 ℃和15 ℃贮藏，每个温度下4 种大蒜样品各放置3 个顶空盒。

气相色谱条件：配置有不锈钢填充柱、氢火焰离子化检测器和CO2转化炉。色谱柱长2 m，内径2 mm，填充物质Porapak80-100。载气N2，流速33 mL/min，助燃气体空气流速150 mL/min。进样温度120 ℃，柱温360 ℃。气相色谱配有色谱工作站，利用N2000 色谱软件进行响应信号处理。

在处理4 种大蒜样品并封装入顶空样品盒后，立即使用手动进样器抽取顶空盒气体进行呼吸强度测定，每个顶空盒都抽取1 次，此即0 h 各样品的呼吸强度。之后分别在 2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 和 60 h 这10 个时间点进行测定。

经过气相色谱仪以及相配的色谱工作站的检测得到色谱图，根据色谱图中的空气峰面积和CO2峰面积进行不同测定时间的呼吸强度的计算，呼吸强度以每小时每千克果蔬（鲜重）在呼吸代谢过程中释放的CO2的体积表示。对比5 ℃和15 ℃条件下的结果并计算温度系数Q10。

1.3.3 蒜氨酸酶的提取与活力测定

1.3.3.1 蒜氨酸酶的提取

4 种大蒜样品入顶空盒于 5 ℃贮藏。在 0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 和 60 h 进行测定。测定时立即于顶空盒中取4 g 样品、取0.2 g 聚乙烯吡咯烷酮、20 mL 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液（pH 6.5）加入研钵，冰浴研磨，装入10 mL 离心管中，使用高压匀浆机破碎匀浆，转速为1 000 r/min。每均质5 s 后停歇5 s，均质6 次，目的是防止过度破碎。之后置入5 ℃低温离心机，13 000 r/min离心30 min，取上清液测定酶活力。

1.3.3.2 蒜氨酸酶活力的测定

采用丙酮酸法测定蒜氨酸酶活力[25-26]。丙酮酸或丙酮酸盐能与2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯肼丙酮酸盐，加碱处理后形成棕红色苯腙。520 nm处有最大光吸收，这一反应也称羰基呈色反应，并具有特异性。酶活力定义：在25 ℃条件下，以蒜氨酸为底物，每分钟反应产生1 μmol 丙酮酸所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

首先制备标准反应体系1 L：0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 6.5）含磷酸吡哆醛25 mmol/L，蒜氨酸5 mmol/L。取1 mL 标准反应体系，于25 ℃条件下保温5 min（以秒表记），加入0.05 mL 蒜氨酸酶液，25 ℃条件下反应5 min，立即加入1.5 mL 10%三氯乙酸终止反应，此时反应体系呈乳白色浊液。再加入0.5 mL 的2，4-二硝基苯肼溶液，25 ℃条件下保温5 min，此时反应体系变为浅黄色。之后加入5 mL 0.5 mol/L NaOH 溶液，反应体系此时迅速变为浅棕色25 ℃条件下保温10 min，于波长520 nm 处测吸光值。以钝化酶为底物，2，4-二硝基苯肼、NaOH 等反应体系为空白对照。

1.3.3.3 丙酮酸钠标准曲线的绘制

制备2 mmol/L 丙酮酸钠，分别取该溶液0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL 于 7 只试管 （规格 10 mL）中，在各试管中加入0.5 mL 的0.1%的2，4-二硝基苯肼溶液（取2，4-二硝基苯肼50 mg，溶于50 mL 2 mol/L盐酸（分析纯6 倍稀释）溶液中，储存于棕色试剂瓶，于4 ℃冷藏备用），25 ℃条件下保温5 min，再分别加入5 mL 0.5 mol/L NaOH 溶液，用去离子水补足到8 mL，25 ℃条件下保温10 min，于波长520 nm 处测吸光值。

1.3.4 感官评定与静态顶空-气相色谱-质谱联用法测定大蒜风味物质

1.3.4.1 感官评定

选取10 名食品专业感官阈值优秀的学生作为此次感官评定的评定员，评定方法如下：对于5 ℃条件下4 种不同伤害程度大蒜的3 个平行处理样，以未处理15 ℃下新鲜整蒜作为对照，评定人员使用嗅闻法对样品进行打分评定。在 0、6、12、24、36、48 h 和 60 h，每名评定员对4 种切割伤害的大蒜样品进行3 次评定打分，每个时间点评定一次，共进行7 次，对结果应用SPSS 软件进行多元方差分析。评分标准为（1）0～2 分：几乎没有大蒜特有味道；（2）3 分～5 分：有轻微的大蒜特有味道；（3）6 分～8 分：存在比较明显的大蒜特有气味；（4）9 分～10 分：存在明显扑鼻的大蒜特有气味。

1）样品前处理

不同贮藏温度的大蒜样品于顶空盒中取出后立即破碎装入10 mL 样品瓶，用带有聚四氟乙烯隔垫的瓶盖使用瓶盖密封器密封，在40 ℃加热平台上保持30 min。使用手动进样针的萃取针头插入样品瓶中，使针头暴露到样品瓶顶空气体中，缓慢匀速抽取1 mL 顶空气体，将针头拔出，注入气相色谱-质谱联用仪进样口，进行气相色谱-质谱联用仪（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）检测。

2）GC-MS 检测条件及分析方法

于 0、6、12、24、36、48 h 和 60 h 这 7 个时间点进行测定。

①色谱条件：色谱柱为DB-1701 色谱柱，柱长30 m，内径0.25 mm，厚度0.25 μm；载气为氦气流量为2.0 mL/min，不分流进样；程序升温起始温度40 ℃，保持 3 min，以 5 ℃/min 的速度升温至 220 ℃，保持 3 min。

②质谱条件：离子源：电子轰击电离（EI），电子能量为70 eV，检测电压为350 V，发射电流为350 μA，离子源温度为200 ℃，接口温度：250 ℃，扫描质量范围为 33 amu～450 amu。

今年正是“两个3年”任务的收官之年。三年来，无论是办社会职能改革还是国有土地确权登记发证，历史问题与现实困境交织，内部掣肘与外部矛盾叠加，改革前行的每一步都不似“轻轻松松、敲锣打鼓”般容易实现。可喜的是，新时代里农垦精神仍然焕发着勃勃生机，农垦人怀着高度的责任感和事业心，涉险滩、闯难关，将改革扎扎实实地推向纵深。

③定性定量方法：定性：通过GC-MS 所带的NIST5.0 图谱库对大蒜挥发性风味成分进行解析，确认挥发性风味成分的各化学组成。定量：利用图谱库工作站数据处理系统按峰面积归一化法进行定量分析，求得各化学成分在挥发性风味物质中的相对含量。

1.4 数据处理

试验数据结果用Microsoft Excel 2016 软件进行统计分析；使用Origin 软件作图；采用SPSS 软件进行方差与标准偏差的分析。

2 结果与讨论

2.1 切割伤害及贮藏温度对大蒜呼吸强度的影响

不同贮藏温度条件下，大蒜呼吸强度在不同切割伤害条件下变化见图1。

呼吸强度以每小时每千克大蒜（鲜重）在呼吸代谢过程中释放的CO2的体积表示。测定后整蒜呼吸强度为21.26 mLCO2/（kg·h），在所有测定时间内呼吸强度基本保持不变，因此可以将整蒜呼吸强度看作常量，直接研究切割伤害过后蒜片、蒜末、蒜泥在不同贮藏温度条件下呼吸强度的变化过程。

图1 不同条件下切割伤害程度大蒜的呼吸强度及温度系数Fig.1 Respiration rate of garlic under different cutting damage and temperature coefficient

从图1 可知，大蒜的呼吸变化过程是明显的跃变型呼吸。由图1A 所示，5 ℃条件下，48 h 的整蒜、蒜片、蒜末和蒜泥均达到了呼吸高峰。不同切割伤害程度下，蒜泥的呼吸强度最大；蒜末的呼吸强度变化程度次之；而蒜片的呼吸强度较弱，呼吸变化过程较为平缓，但是仍然高于未受伤害整蒜的21.26 mLCO2/（kg·h）的呼吸强度。在5 ℃的贮藏温度下，切割伤害对大蒜的呼吸强度变化具有非常明显的作用变化。大蒜随着切割伤害程度的增大，呼吸强度变化更为明显，同时在受到切割伤害后，呼吸强度在0～2 h 大幅度增强，使蒜氨酸与蒜氨酸酶可以更活跃地结合生成的大蒜素并产生风味物质。

由图1B 所示，15 ℃条件下，36 h 的整蒜、蒜片、蒜末和蒜泥均达到了呼吸高峰。相较于5 ℃，大蒜呼吸高峰提前到来，体现出高温对大蒜呼吸代谢的促进作用。不同切割伤害程度下，蒜泥的呼吸强度最大，蒜末的呼吸强度次之，蒜片的呼吸强度的变化仍旧较为平缓。

由图1C 所示，大蒜的温度系数在1～10 之间波动，最高值为12 h 的蒜末，达到了8.12。温度系数Q10表示温度每升高10 ℃时反应速度所增加的倍数。低温保藏可以抑制反应速度，所以温度商数越高，低温保藏的效果就越显著。大蒜的温度系数明显高于大多数的果蔬，表明低温可以有效提高大蒜的贮藏期、保持大蒜品质。

15 ℃呼吸高峰提前到来，5 ℃低温条件延缓了呼吸高峰的到来，表明低温有助于大蒜的贮藏，延缓了大蒜的衰老，利于延长大蒜产品的货架期。在5 ℃和15 ℃温度下蒜泥在切割伤害初期，即0～12 h 呼吸强度增加得最为迅速，因此蒜泥中蒜氨酸与蒜氨酸酶结合得更为充分，大蒜素大量产生，风味物质的合成也更为充分。同时，5 ℃的贮藏条件下大蒜的呼吸强度最大的蒜泥也不超过400 mLCO2/（kg·h），而15 ℃的贮藏条件下大蒜的呼吸强度可以达到接近2 000 mLCO2/（kg·h），可见贮藏温度对于大蒜的呼吸也具有决定性的影响。5 ℃贮藏条件下切割伤害大蒜呼吸强度明显低于15 ℃贮藏条件下大蒜呼吸强度。常温条件下，大蒜呼吸剧烈，提前衰老，不利于大蒜的贮藏和次生代谢物质的合成。

2.2 切割伤害及贮藏温度对蒜氨酸酶活力的影响

蒜氨酸酶活力在不同切割伤害条件下变化见图2。

图2 不同切割伤害对蒜氨酸酶活力的影响Fig.2 Effect of different cutting damage on the activity of allinase

5℃作为果蔬事宜的贮藏温度，如图2 所示，整蒜在切割伤害后的蒜氨酸酶活力递减，并无活力上升过程；蒜片、蒜末和蒜泥的蒜氨酸酶活力在0～2 h 迅速上升，在2 h 左右达到峰值而后迅速下降。0～12 h 大蒜蒜氨酸酶活力迅速减小，12 h 之后减小速率放缓，但仍在持续减小。因此，大蒜受到伤害后12 h 内是蒜氨酸酶活力减小的主要阶段。前12 h 蒜片、蒜末和蒜泥的蒜氨酸酶活力先升后降，这与大蒜素在蒜泥切割伤害条件下的变化趋势相近[27]。从0～12 h，切割伤害程度最大的蒜泥中蒜氨酸酶活力最大，蒜末的蒜氨酸酶活力降到最小。从12 h～36 h，蒜泥的蒜氨酸酶活力迅速降至4 种样品的最低值。36 h 以后，4 种样品的呼吸强度以整蒜-蒜片-蒜末-蒜泥的顺序由大到小排列，而这正是大蒜所受到的切割伤害由小到大的排列顺序。可见，大蒜所受切割伤害程度越大，蒜氨酸酶活力越大，但同时酶活力随着时间的变化减小得也越快。整蒜可以最佳地保持蒜氨酸酶活力。

2.3 切割伤害及贮藏温度对大蒜挥发性风味物质的影响

2.3.1 切割伤害对大蒜风味的影响

大蒜风味物质的感官评定的多变量检验见表1。

表1 大蒜风味物质的感官评定的多变量检验Table 1 Multivariate test for sensory evaluation of garlic flavor compounds

续表1 大蒜风味物质的感官评定的多变量检验Continue table 1 Multivariate test for sensory evaluation of garlic flavor compounds

表2 感官评定不同切割伤害主体间效应的检验Table 2 Test for sensory evaluation of the effect of different cutting damage among subjects

续表2 感官评定不同切割伤害主体间效应的检验Continue table 2 Test for sensory evaluation of the effect of different cutting damage among subjects

各贮藏时间评定员的感官评定分数经SPSS 软件进行差异显著性分析，由表1 和表2 所示，检验统计量的值可以得到4 种切割伤害程度的风味感官评定F值都具有统计学意义，说明大蒜的不同切割伤害程度之间存在差异性。在a=0.05 水平上，大蒜4 种切割伤害程度之间的风味程度差异显著，样品与各个评定员之间不存在显著差异，说明10 名评定员对于相同贮藏时间的相同切割伤害程度的大蒜风味认可度较一致，且评定员与样品之间没有交互作用，则大蒜风味的感官评定评分很可靠。感官评定过程中所有样品风味强度呈明显下降趋势。由于整蒜未经伤害，所以在初始0～12 h 略有风味之后便已没有了风味。而切割伤害后前12 h 时，蒜泥风味最强，12 h 开始，蒜泥风味减弱，至48 h 蒜末的风味最强，48 h 之后蒜片的风味保持最强。与蒜氨酸酶活力十分相似的是，大蒜风味强度是按照切割伤害破碎程度的大小排列的，即蒜泥-蒜末-蒜片，切割伤害程度越小，大蒜风味保持的越好。

2.3.2 切割伤害后大蒜风味物质检测

图3 6 h 整蒜、蒜片、蒜末和蒜泥的挥发性风味物质检测总离子流图Fig.3 Determination of total ion flow in volatile flavor compounds of unbroken garlic，garlic slice，minced garlic and mashed garlic in the 6th hour

大蒜风味物质在不同切割伤害程度下的变化见图3。0～60 h 大蒜挥发性物质相对含量见表3～表9。

大蒜受到切割伤害后各时间点的GC-MS 挥发性风味物质总离子流图变化趋势基本一致，而6 h 的离子流图变化最为明显，随着切割伤害程度加深而更加丰富。由离子流图分析所得，由表3 至表9 不同切割伤害大蒜0～60 h 风味物质变化可知，60 h 整蒜检测出的风味物质最少只有16 种，6 h 的蒜泥检测出的风味物质最多，有25 种。二烯丙基二硫化物是风味物质中最主要的物质，在相对含量的50%以上。二烯丙基二硫化物具有大蒜的特征香味，是形成大蒜风味的最主要物质[28]。相对含量次之的是甲基-2-丙烯基二硫化物，相对含量在10%左右。构成风味物质的成分基本为二硫化物、三硫化物以及硫醚类、噻吩类物质。二（2-丙烯基）三硫化物被称作大蒜新素，是大蒜各类风味物质的前体，大蒜次生代谢的重要物质之一，由表中可以看出，切割伤害程度最大的蒜泥的大蒜新素相对含量最大。甲基烯丙基硫醚也有较高的相对含量，它是大蒜次生代谢物质之一，具有硫醚类特有气味，是“大蒜味口臭”形成的最主要物质。这些硫醚类物质绝大部分具有大蒜、洋葱的辛辣味，而且有许多成分的阈值极低。这些高含量、低阈值的硫醚类物质是大蒜风味的主要影响因子。

表3 0 h 不同切割伤害程度大蒜挥发性风味物质的相对含量Table 3 Relative content of volatile flavor compounds in garlic with different cutting damage in the 0th hour

续表3 0 h 不同切割伤害程度大蒜挥发性风味物质的相对含量Continue table 3 Relative content of volatile flavor compounds in garlic with different cutting damage in the 0th hour

表4 6 h 不同切割伤害程度大蒜挥发性风味物质的相对含量Table 4 Relative content of volatile flavor compounds in garlic with different cutting damage in the 6 th hour

表5 12 h 不同切割伤害程度大蒜挥发性风味物质的相对含量Table 5 Relative content of volatile flavor compounds in garlic with different cutting damage in the 12 th hour

表6 24 h 不同切割伤害程度大蒜挥发性风味物质的相对含量Table 6 Relative content of volatile flavor compounds in garlic with different cutting damage in the 24th hour

表7 36 h 不同切割伤害程度大蒜挥发性风味物质的相对含量Table 7 Relative content of volatile flavor compounds in garlic with different cutting damage in the 36th hour

表8 48 h 不同切割伤害程度大蒜挥发性风味物质的相对含量Table 8 Relative content of volatile flavor compounds in garlic with different cutting damage in the 48th hour

表9 60 h 不同切割伤害程度大蒜挥发性风味物质的相对含量Table 9 Relative content of volatile flavor compounds in garlic with different cutting damage in the 60th hour

如表3 至表9 所示，0～6 h 大蒜挥发性物质与之后4 个时间段大蒜挥发性物质的对比可以看出，0 h 具有唯一的产物烯丙硫醇，烯丙硫醇具有强烈的蒜样气味，在周江菊等[29]的文献中皆有测出，但是本研究中仅在0 h 大蒜刚刚切割时测得，相对含量0.03%，之后检测中再未测得，可见烯丙硫醇在大蒜受到切割伤害后含量骤减。同时在6 h 也检测出了另外2 类特有成分烯丙基硫代乙酸甲酯和2-烯丙基四硫化物。而在6 h的蒜片、蒜末、蒜泥中检测到1 种特有物质甲基烯丙基三硫醚，在6 h 的蒜末和蒜泥中检测到2 种特有物质二异-1，2，4-三硫环戊烷和2-羟基-3-甲氧基琥珀酸二甲酯，仅仅在6h 的蒜泥中检测到2 种特有物质（Z）-5-甲硫基-4-戊烯-2-醇和环己硫醚，此时大蒜特有风味最浓，而2-羟基-3-甲氧基琥珀酸二甲酯曾在大蒜油中检测到[30]，（Z）-5-甲硫基-4-戊烯-2-醇C6H12OS 是合成二烯丙基二硫化物的前体，综上可以看出，0～6 h 的受伤大蒜尤其是蒜泥产生了一些以往文献中其他条件下所未检测到的大蒜风味前体物质，由此可见不同的切割伤害程度对大蒜次生代谢风味物质的合成有着极其重要的影响。

3 结论

切割伤害对于大蒜的生理活动以及各类次生代谢合成的影响是明显的，而不同切割伤害的程度以及伤害后贮藏时间与温度对于大蒜的影响又是有差异的。切割伤害程度越大，大蒜的呼吸强度越大，大蒜受切割伤害后代谢活动越剧烈。同时，15 ℃的高温将5 ℃低温条件下48 h 的呼吸高峰提前到36 h 左右。呼吸强度增大的同时，4 种大蒜样品的蒜氨酸酶活力在前12 h减少近2/3，但蒜片、蒜末和蒜泥的蒜氨酸酶活力在切割伤害后2 h 是骤增的，蒜氨酸酶活力的增大导致大蒜素含量显著提高，蒜泥的大蒜素含量在大蒜受伤后0～6 h 达到最大，大蒜素产生的挥发性风味物质在切割伤害后每个阶段各有不同，6 h 的蒜泥具有最多的25 种挥发性风味物质，各阶段主要的挥发性成分为二烯丙基二硫化物。

同时，程度越大的切割伤害或者较高的温度（15 ℃）会越早的带来大蒜的呼吸高峰，使得大蒜提前衰老，同时也使挥发性物质更早的挥发掉。而5 ℃的低温则更好地减弱大蒜呼吸强度，延缓大蒜呼吸高峰的到来，有助于延长大蒜的贮存期，且能够显著提高不同切割伤害程度大蒜的次生代谢物质中的大蒜素含量，保持蒜氨酸酶活力，从而很好地保留大蒜挥发性风味物质。