Box-Behnken中心组合设计优化酶法提取马齿苋多糖的工艺

陈凌 曹巧巧 张建群

摘要：采用Box-Behnken中心组合试验设计，以果胶酶添加量、酶解温度、料液比为自变量，以多糖得率和羟基自由基（·OH）清除率为因变量，利用响应面法优化果胶酶酶解提取马齿苋多糖的工艺。结果表明，料液比1∶37（g/ml）、果胶酶添加量10.67 g/kg、酶解温度36.4 ℃、pH值5.0、酶解时间80 min条件下，马齿苋多糖得率预测值与测定值的相对标准偏差为2.29%，模型拟合度较高。体外抗氧化试验结果表明，马齿苋多糖具有较好的抗氧化性。因此，采用响应面法优化酶法提取马齿苋多糖工艺条件是可行的。

關键词：Box-Behnken中心组合设计;马齿苋;多糖;酶解提取

中图分类号：TS201.1文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）02-0500-07

Abstract： The Box-Behnken central composite design was used in this study. Taking pectinase addition， hydrolysis temperature and solid-liquid ratio as independent variables， the extraction rate of polysaccharides and the clearance rate of hydroxyl radical（·OH） as dependent variables， the response surface method was adopted to optimize the enzymatic extraction process of polysaccharides from Portulaca oleraceae L.. The results showed that the optimal conditions were as follows∶the solid-liquid ratio was 1∶37 （g/ml）， pectinase addition was 10.67 g/kg， hydrolysis temperature was 36.4 ℃， pH value was 5.0， and enzymolysis time was 80 min. Under the optimal conditions， the relative standard deviation of polysaccharide yield between the predicted value and the measured value was 2.29%， and the model fitting degree was high. The results of antioxidant test in vitro indicated that polysaccharides from Portulaca oleracea L. had better antioxidant properties. Therefore， it is feasible to optimize the extraction conditions of Portulaca oleracea L. polysaccharides by the method of response surface.

Key words：Box-Behnken central composite design;Portulaca oleracea L.;polysaccharide;enzymatic extraction

马齿苋（Portulaca oleracea L.）为马齿苋科一年生肉质草本植物，在中国分布广泛，是中国卫生部划定的药食两用植物之一[1]。多糖作为马齿苋药材中一种非常重要的活性成分，有抗癌、抗氧化和降糖等生物活性作用[2]。马齿苋多糖对核桃油的抗氧化性较好[3]。因此，有效提取马齿苋多糖，对开发多功能食品抗氧化剂具有重要意义。酶法提取多糖使得植物细胞壁及组织能够快速降解[4]，具有反应温度温和，易于控制等诸多优点[5]。目前，酶法提取马齿苋多糖的工艺已有一些研究。钱志伟等[6]用纤维素酶提取马齿苋多糖，吕萍等[7]比较了木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶酶解提取马齿苋多糖的效果，米热班古·木太力甫等[8]用纤维素酶超声辅助法提取马齿苋多糖，上述研究均以多糖含量为指标，用正交试验法研究马齿苋多糖的提取工艺。李良等[9]建立苯酚-硫酸法的多糖测定原理是：利用浓硫酸将多糖水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，再与苯酚缩合成有色化合物，用分光光度法测定多糖含量。在酶法提取植物多糖的工艺研究中，若用苯酚-硫酸法测定多糖含量，需要以双因子为应变量，以防止酶解过度产生的葡萄糖对多糖测量结果的影响。在利用不同酶酶解提取马齿苋多糖的体外抗氧化试验中，从马齿苋多糖对铁离子（Fe3+）和铈离子（Ce4+）的还原能力，对超氧阴离子（O2·-）和羟基自由基（·OH）的清除率这4个方面进行综合评价，发现果胶酶酶解提取的多糖抗氧化性最强[10]。本研究拟以多糖得率和·OH清除率为响应值，采用响应面法优化果胶酶酶解提取马齿苋多糖的工艺，修正酶解过度产生的误差，以期为马齿苋多糖的高效提取提供技术支撑。

1材料与方法

1.1试验材料与试剂

马齿苋采自嘉兴有机农业示范园，经嘉兴职业技术学院园艺教研室陈玉琴副教授鉴定。葡萄糖、浓硫酸、苯酚、无水乙醇、浓盐酸、水杨酸、双氧水、柠檬酸、柠檬酸钠均为分析纯，由上海联试化工试剂有限公司提供。FeSO4·7H2O由江苏强盛功能化学股份有限公司提供，Na2SO4由兰溪中星化工试剂有限公司提供，Ce（SO4）2·4H2O由北京康普汇维科技有限公司提供，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）由东京化成工业株式会社提供，VC由天津博迪化工股份有限公司提供，果胶酶（含量99%）由无锡市百瑞多化工产品有限公司提供。

1.2仪器与设备

试验所用仪器有CP225D型1/100 000电子分析天平（SATORIOS公司产品）、JP-500B-2型多功能粉碎机（上海久品贸易有限公司产品）、UV-1102Ⅱ型单光束紫外/可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司产品）、DK-S24型恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司产品）、DGG-9240BD型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司产品）、Millipore超纯水仪（Merck millipore公司产品）、Smartpark DQ3纯水柱（Merck millipore公司產品）。

1.3试验方法

1.3.1马齿苋多糖的提取新鲜马齿苋洗净，50 ℃烘干后粉碎，用石油醚脱脂后50 ℃烘干。以超纯水为溶剂，酶解一定时间后，加热至100 ℃灭酶5 min，离心分离，取上清液，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.3.2马齿苋多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品（纯度≥99%），利用分光光度计测定多糖含量[10]。

1.3.3马齿苋多糖对·OH清除率的测定采用水杨酸捕获法测定马齿苋多糖对·OH的清除率[11]。

1.3.4还原能力的测定基于金属离子还原能力的抗氧化能力评价方式，根据四价铈离子[Ce（Ⅳ）]和三价铈离子[Ce（Ⅲ）]之间的转化度，评价样品的总还原能力[12]。

1.3.5马齿苋多糖对DPPH自由基清除率的测定准确称取30.6 mg DPPH，用70%乙醇溶解后定容于500.0 ml容量瓶中，作为储备液贮藏在棕色瓶中，置于4 ℃的冰箱中保存，用时取出。DPPH溶液呈紫红色，加入抗氧化剂后颜色的变淡程度可以表示其对自由基的清除能力。取0.5 ml马齿苋多糖溶液，加入10.0 ml DPPH乙醇溶液，摇匀，37 ℃避光反应15 min，在523 nm处测定其吸光度（以70%乙醇为空白调零），重复测定3次，取平均值。根据下列公式计算样品对DPPH自由基的清除率：

DPPH清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

式中，A0表示加入0.50 ml水时溶液的吸光值，Ai表示加入0.50 ml样品时溶液的吸光值，Aj表示在0.50 ml样品中加入70%乙醇的吸光值。

1.3.6单因素试验按照试验方法1.3.1中所述的方法提取马齿苋多糖，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调整pH值，酶解后在沸水浴中灭酶5 min。酶添加量（0 g/kg、5.0 g/kg、7.5 g/kg、10.0 g/kg、12.5 g/kg、15.0 g/kg）对马齿苋多糖得率及·OH清除率的影响，其他提取条件为料液比1∶25（g/ml）、pH值5.0、酶解温度40 ℃、酶解时间60 min。pH值（3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0）对马齿苋多糖得率及·OH清除率的影响，其他提取条件为料液比1∶25（g/ml）、酶添加量10.0 g/kg、酶解温度40 ℃、酶解时间60 min。酶解时间（30 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min）对马齿苋多糖得率及·OH清除率的影响，其他提取条件为料液比1∶25（g/ml）、pH值5.0、酶添加量10.0 g/kg、酶解温度40 ℃。酶解温度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃）对马齿苋多糖得率及·OH清除率的影响，其他提取条件为料液比1∶25（g/ml）、pH值5.0、酶解时间60 min、酶添加量10.0 g/kg。料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/ml）对马齿苋多糖得率及·OH清除率的影响，其他提取条件为pH值5.0、酶添加量10.0 g/kg、酶解温度40 ℃、酶解时间60 min。

1.3.7Box-Behnken中心组合试验设计在单因素试验的基础上，选定对多糖得率和·OH清除率影响较大的3个因素，建立三因素三水平的Box-Behnken中心组合试验，以多糖得率和·OH清除率为响应值，各因素及水平如表1显示。

1.3.8数据统计与分析所有测定均重复3次，数据采用平均值±标准差的形式表示。采用Origin Pro 9.0软件作图，用Design-Expert 8.0.6软件进行方差分析。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1酶添加量对多糖得率及·OH清除率的影响图1显示，随着果胶酶添加量的增加，马齿苋多糖的吸光度和·OH清除率均呈先上升后下降的趋势。这是因为酶添加量增加导致酶解速度加快，当果胶酶的添加量大于10 g/kg时，底物全部与酶结合，多余的酶进一步酶解多糖，使多糖的浓度降低，导致其对·OH的清除率降低，这与邹雪等[13]的研究结果相吻合。多糖浓度最大时，其对·OH的清除率并不是最大的，原因可能是测得的多糖包含了酶解过度产生的葡萄糖。因此，选择果胶酶添加量为10 g/kg。

2.1.2pH值对多糖得率及·OH清除率的影响图2显示，pH值小于5.0时，随着pH值的增大，吸光度和·OH清除率增加。当pH值达到5.0后，继续增大pH值，吸光度和·OH清除率降低。这是因为在最适pH值时，酶分子上的活性基团发生解离，其离子最适合与底物结合，故多糖得率最高，·OH清除率也最大。当pH值高于或低于最适pH值时，活性基团的解离状态可能发生改变，酶与底物的结合力减弱，酶反应速率降低，多糖得率降低[14]，·OH清除率也减小。因此，选择pH值为5.0。

2.1.3酶解时间对多糖得率及·OH清除率的影响图3显示，马齿苋多糖吸光度随着酶解时间的增加而增加，·OH清除率在酶解时间为80 min时达到最大，之后随酶解时间的增加而下降。说明，酶解时间对多糖得率有着比较明显的影响，时间过短，多糖提取不充分，时间过长，可能引起多糖分解，导致其对·OH的清除率减少。综合考虑，确定酶解时间为80 min。

2.1.4酶解温度对多糖得率及·OH清除率的影响图4显示，酶解温度为35 ℃时吸光度和·OH清除率最高，酶解温度为35～55 ℃时，随着酶解温度升高，吸光度和·OH清除率下降，这可能是因为温度升高导致酶失活。酶解温度高于55 ℃时，吸光度和·OH清除率又开始上升，这是因为提取剂温度的升高使多糖的提取率增加。因此，最适酶解温度为35 ℃。

2.1.5料液比对多糖得率及·OH清除率的影响表2显示，当料液比为1∶30（g/ml）时，吸光度及·OH清除率最高。原因可能是当提取剂比较少时，不利于多糖的溶出，使得多糖得率较低，对·OH的清除率也较低，而当提取剂体积过大时，酶浓度降低导致酶解作用下降，并且多糖成分已充分溶出，因此多糖得率会趋于恒定甚至下降[15]，从而对·OH的清除率恒定甚至降低。因此，采用料液比1∶30（g/ml）来完成进一步的优化试验。

2.2响应面法优化试验

在单因素试验的基础上，采用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken的试验设计，以酶添加量、酶解温度、料液比为自变量，以马齿苋多糖得率和·OH清除率为响应值，具体试验方案见表3。

表4显示，回归模型对马齿苋多糖得率的影响显著（P=0.024 1<0.050 0，相关系数为0.924 4），回归模型对·OH清除率的影响极显著（P=0.001 6<0.010 0，相关系数为0.975 6），表明该回归模型的拟合情况良好，回归模型的代表性较好，能准确地预测实际情况。对多糖得率的回归模型进行分析，酶解温度与料液比的F值较大，交互作用较大;对·OH清除率的回归模型进行分析，酶添加量与酶解温度的F值较大，交互作用较大。

多糖得率的校正决定系数为0.788 3，表明此模型能解释78.83%的多糖得率的变化。·OH清除率的校正决定系数为0.931 8，表明此模型能解释93.18%的·OH清除率变化。多糖得率的变异系数为0.095 1%，·OH清除率的变异系数为0.626 1%，说明试验离散性小，该模型拟合程度较好，试验误差小，可以用来进行分析和预测。由线性项可以看出，酶解温度对多糖提取率的影响最大，其次是酶添加量，第三是料液比。

采用Design-Expert.V8.0.6软件制作响应面图，根据响应面图曲面坡度越陡峭，等高线越密集成椭圆形表示两因素交互影响越大的原则[16]进行分析。多糖得率响应面图（图5）显示，酶解温度与料液比之间的交互作用较大。·OH清除率响应面图（图6）显示，酶添加量与酶解温度之间的交互作用较大，与表4结论一致。

2.3验证试验

利用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行优化，果胶酶酶解提取马齿苋多糖的最佳工艺参数为：酶解pH值5.0、酶解时间80 min、酶添加量10.67 g/kg、料液比1∶37（g/ml）、酶解温度36.4 ℃。在此条件下，马齿苋多糖得率理论值为6.06%，对·OH清除率为68.40%。为检验响应面法所得结果的准确性和可靠性，又考虑到实际操作的情况，将提取工艺参数修正为：酶解pH值5.0、酶解时间80 min、酶添加量10.67 g/kg、料液比1∶37（g/ml）、酶解温度36.0 ℃，做3次平行试验，多糖平均得率为6.20%，与理论预测值相比，相对标准偏差为2.29%，基于响应面法所得的优化提取工艺参数准确可靠。

2.4马齿苋多糖与VC抗氧化活性比较

图7显示，随着马齿苋多糖和VC体积的增加，DPPH清除率也逐渐增加，所试范围内马齿苋多糖提取液（多糖质量分数为0.053%）对DPPH的清除能力小于VC（质量分数为0.100%）。

图8显示，随着马齿苋多糖和VC体积的增加，Ce（Ⅳ）还原能力逐渐增加，并呈现良好的线性关系，所试范围内马齿苋多糖提取液对Ce （Ⅳ）的还原能力大于VC。

3结论

在单因素试验的基础上，采用响应面法对果胶酶酶解提取马齿苋多糖的工艺进行优化，影响马齿苋多糖提取的工艺因素表现为酶解温度>酶添加量>料液比。最终确定了其最优工艺条件为：酶解pH值为5.0，酶解时间为80 min，酶添加量为10.67 g/kg、料液比为1∶37（g/ml）、酶解温度为36.4 ℃。回归模型预测多糖得率为6.06%，验证试验的马齿苋多糖得率为6.20%。体外抗氧化试验结果表明，马齿苋多糖具有较好的抗氧化性。

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（责任编辑：王妮）