FOXC2通过上调MMP9促进非小细胞肺癌细胞的侵袭迁移

姬路鹏 张毅 梁庭都 吕诗敏

肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，居我国恶性肿瘤的首位［1］。肺癌中约85%为非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）［2］。NSCLC 恶性程度高、预后差，尽管针对NSCLC 的靶向治疗已取得了显著疗效，但NSCLC 总体的五年生存率仍然较低［3］。如何进一步揭示NSCLC 发生发展的关键驱动基因，明确有效的干预靶点，具有重要的科学意义。FOX（Forkhead box）家族是由保守氨基酸序列组成的DNA 结构域。FOX 基因家族介导了多种生物学功能，包括胚胎发育、细胞周期调控和代谢调控等，这提示我们FOX 基因家族有可能也参与了肿瘤的发生发展［4］。FOXC2 在血管生成和淋巴管生成过程中发挥重要作用。尽管最新的研究提示，FOXC2 在肿瘤中的作用越来越凸显，但目前关于FOXC2 在NSCLC 中的研究较少，尤其是在NSCLC侵袭转移方面的研究，而且作用机制尚未明确。本研究拟在NSCLC 细胞中过表达FOXC2 的表达水平，检测其对NSCLC 细胞侵袭转移能力的影响，并初步探讨可能的分子机制，以期为NSCLC 的治疗提供可能的新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人NSCLC 细胞系H1299 细胞和A549 细胞及正常人支气管上皮样细胞系HBE 细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（上海，中国）。细胞培养采用含10%的胎牛血清FBS（Gibco，Thermo Fisher Scientific，美 国）的Dulbecco’s modified Eagle medium（DMEM）培养基（凯基，南京，中国），所有的培养基中均添加100 μg/ml 青霉素G 和100 μg/ml 链霉素（凯基）。细胞均置于5%CO2、37 ℃饱和湿度的恒温培养箱中进行培养。

1.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR） 应用RNAiso Plus 试剂（Takara，大连，中国）从细胞中提取RNA；然后应用PrimeScriptTMRT Master Mix 反转录试剂盒（Takara）将RNA 反转录为cDNA；再以cDNA 为模板，用TB Green®Fast qPCR Mix 实时荧光定量PCR 试剂盒（Takara）进行qRT-PCR 扩增反应。qRT-PCR 扩增反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共40 个循环。βactin 作为内参，以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。FOXC2上游引物序列：5′-CCTCCTGGTATCT CAACCACA-3′，下游引物序列：5′-GAGGGTCGA GTTCTCAATCCC-3′；MMP9 上 游 引 物 序 列：5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3′，下 游 引 物 序列：5′-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3′；β-actin 上游引物序列：5′-GAAATCGTGCGTGACATTAA-3′，下游引物序列：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。1.3 Western blot 用预冷的PBS 将细胞清洗2遍；然后用Western blot 细胞裂解液（碧云天，江苏，中国）冰上充分裂解细胞，离心机12 000 rpm 离心弃掉沉淀，提取总蛋白；BCA 试剂盒（碧云天）测定蛋白浓度。提取的蛋白质采用SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质；然后转膜至甲醇激活的PVDF 膜上；采用5%脱脂奶粉室温封闭1h；TBST 洗涤5min（3 次）；加 入 相 应 的 一 抗 抗 体（FOXC2，Cell Signaling，#12974；β-actin，Cell Signaling，#3700）4℃孵育过夜；TBST 洗涤5min（3 次）；加入对应的二抗后室温下孵育1 h；TBST 洗涤5 min（3 次）；ECL 发光液（碧云天）曝光，ImageJ 测量条带的灰度值，以目的蛋白/内参灰度值之比反应蛋白相对表达水平。

1.4 细胞转染 pcDNA3.1-FOXC2 重组质粒由上海生工生物公司构建。采用Lipofectamine 2000（Thermo Scientific，美国）进行转染；转染过程采用无血清的Opti-MEM 培养基（Thermo Scientific）；转染48 h 后收集细胞提取RNA 和蛋白质通过qRTPCR 和Western blot 验证转染效率。

1.5 Transwell 胰蛋白酶消化后离心收集细胞；无血清培养基重悬细胞并充分混匀；迁移实验中，细胞计数后调整细胞密度为5×104个细胞/200 μl接种于Transwell 小室（Corning，8 μm）；在下室中加入600 μl 含有10% FBS 的完全培养基；置于37℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中进行培养；24 h后用棉签轻轻擦去上室中的细胞；4%多聚甲醛中固定5 min；然后用0.01%的结晶紫溶液（碧云天）染色5 min；最后双蒸水漂洗后晾干，随机选取5 个视野在倒置显微镜下拍照并进行计数。侵袭实验开始的前1 天，在Transwell 小室内加入充分的含有基质胶（BD，美国）的DMEM 培养基（基质胶∶DMEM 培养基=1∶8）30 μl 于培养箱中过夜待用；细胞密度为1×105个细胞/200 μl。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件（IBM，美国）进行数据处理。计量资料用（±s）表示，每组数据来自3 次独立的实验，采用t 检验分析各组差异的显著性。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FOXC2 在人NSCLC 细胞中表达上调 为了检测FOXC2 在NSCLC 中的表达水平，我们首先通过qRT-PCR 的方法检测了NSCLC 细胞系H1299 细胞、A549 细胞和人支气管上皮样细胞HBE 细胞中FOXC2 的mRNA 表达水平。通过研究发现，对比正常人支气管上皮样细胞HBE，人NSCLC 细胞系H1299 细胞、A549 细胞的FOXC2 的表达水平较高（P＜0.05，见图1A）。因A549 细胞的FOXC2 表达水平相比H1299 细胞较低，所以后续实验采用A549细胞为研究对象。

图1 FOXC2 在NSCLC 细胞中的表达水平

2.2 FOXC2 过表达促进了A549 细胞侵袭迁移能力 为了探讨FOXC2 在NSCLC 中的作用，FOXC2 重组过表达质粒用于构建A549-FOXC2 过表达细胞模型，过表达效率通过qRT-PCR 和Western blot 进行验证。结果发现，与对照组（pcDNA-vector）相比，NSCLC 细胞A549 的FOXC2的mRNA 和蛋白水平明显上调（P＜0.05，见图1BC）。为了探讨FOXC2 对于NSCLC 细胞A549 侵袭迁移能力的影响，通过Transwell 实验探讨A549 在过表达FOXC2 前后侵袭迁移能力的变化。Transwell 迁移实验结果显示，过表达FOXC2 明显促进了NSCLC 细胞A549 的侵袭迁移能力（P＜0.05，见图2A）。

图2 FOXC2 过表达促进了A549 细胞的侵袭迁移

2.3 FOXC2 过表达上调了MMP9 的表达 通过qRT-PCR 法 检 测 过 表 达FOXC2 后，NSCLC 细 胞A549 的MMP9 的表达情况。结果显示，相比对照组pcDNA-vector），转染pcDNA-FOXC2 过表达质粒，MMP 表达水平上调（P＜0.05，见图2B）。

3 讨 论

在世界范围内，肺癌是导致癌症相关死亡率的主要原因之一［1］。主要病理类型为NSCLC［2］。尽管针对NSCLC 的治疗已经有了巨大的进步，但其5 年生存率仍然较低［3］。NSCLC 早期诊断较为困难，临床上确诊的NSCLC 病例往往已经处于中晚期［3］。因此，急待开发新的针对NSCLC 的治疗靶点。为研究FOXC2 对NSCLC 细胞侵袭转移能力的影响，我们首先通过qRT-PCR 的方法检测了NSCLC 细胞系和人支气管上皮样细胞中FOXC2 的mRNA 表达水平。结果显示，FOXC2 在人NSCLC细胞H1299、A549 中的表达较人支气管上皮样细胞HBE 高，提示FOXC2 在NSCLC 的发生发展中可能发挥重要的作用；继而，我们以FOXC2 表达相对较低的A549 细胞为研究对象，探讨FOXC2 对于NSCLC 细胞侵袭迁移能力的影响。本研究将重组质粒pcDNA3.1-FOXC2 转染至A549 细胞，上调A549 细胞中FOXC2 的表达，结果显示转染pcDNA3.1-FOXC2 质粒后，A549 细胞的增殖能力上升；过表达FOXC2 能够促进A549 细胞的侵袭迁移能力，提示在NSCLC 细胞中FOXC2 起促癌的作用。FOXC2 属于FOX 转录因子超家族的一员，作为关键的癌基因，参与多种恶性肿瘤的发生发展，在乳腺癌、结直肠癌中高表达，在NSCLC 中表达水平同样异常上调。研究发现FOXC2 与乳腺癌EMT相关，同样的结果得到相关研究的验证，FOXC2 在乳腺癌转移过程中发挥重要作用，且与侵袭性乳腺癌相关［6］。另外，有研究表明FOXC2 通过抑制FOXO3a 并激活MAPK/AKT 信号通路促进结直肠癌的增殖［7］。本研究结果显示过表达FOXC2 同样促进了NSCLC 细胞的侵袭迁移能力。肿瘤的转移是一个复杂过程，与细胞内信号转导有关。基质金属蛋白酶家族参与调控肿瘤细胞的侵袭迁移过程［8］。肿瘤细胞合成和分泌MMP 降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的侵袭转移［9］。MMP9 是MMPs家族重要成员，与肿瘤的侵袭转移密切相关，在多种肿瘤组织中表达上调［10］。本研究发现FOXC2可能通过上调MMP9 从而促进NSCLC 细胞的侵袭迁移。

综上所述，本研究证实FOXC2 在NSCLC 细胞中呈高表达，过表达FOXC2 可能通过上调MMP9的表达促进NSCLC 细胞的侵袭迁移，为NSCLC 的进一步治疗提供可能的靶点。