NLRC5调节转化生长因子-β1诱导的肝星状细胞活化及逆转对肝纤维化的影响

张燕，范晓翔，章美武，庄鲁辉，毛达峰

肝纤维化是由不同病因引起的持续性慢性肝损伤的常见结果，在损伤因子的作用下，病情呈动态进展，可逐渐形成肝硬化进而引起一系列严重并发症，包括门脉高压、肝衰竭和肝细胞癌等，并增加患者死亡率［1-2］。目前，早期肝纤维化的治疗已成为世界性的重大难题。即使在高效抗病毒治疗的时代，大多数慢性肝病患者也无法获得根本性治疗，肝移植仍然是治疗失代偿性肝硬化或肝癌的唯一有效方法［3］。因此，开发有效的抗纤维化药物来阻止肝硬化进展，甚至逆转晚期肝纤维化极为迫切。长期以来，肝纤维化被认为是一个不可逆的过程。然而近期研究提示，肝纤维化是可逆的，且其与肝细胞失活紧密相关，即通过细胞衰老、凋亡或激活回到更为静止的表型［4］。核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体（NLRs）、Toll样受体（TLRs）能诱导炎性细胞死亡，参与调节先天免疫和适应性免疫，在肝细胞失活过程中扮演着重要角色［5］。NLRC5是NLRs家族最主要的成员，在免疫组织或器官如脾脏、肺、胸腺和肝脏中有较强表达，可介导炎症抑制及抗病毒反应。最近研究表明，NLRC5通过抑制κB抑制蛋白激酶α抗体（IKKα）和κB抑制蛋白激酶β抗体（IKKβ）的磷酸化，负性调节核因子（NF）-κB信号通路，在肝脏中高度表达［6］。LI等［7］研究显示，降低RAW264.7小鼠巨噬细胞中NLRC5的表达可有效上调脂多糖促炎反应，包括促进白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF）的分泌。以上研究提示NLRC5是一种重要的负性炎症途径调节因子［8］。然而，关于NLRC5在肝纤维化中的作用还没有进一步的研究报道。本研究旨在探讨NLRC5在转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的肝星状细胞（HSC）活化中的作用，并探讨其与肝纤维化的关系，以评估其临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 体内实验

1.1.1 体内实验建模 2018年3—7月选取24只8周龄雄性C57BL/6小鼠（体质量15～20 g），由宁波市第二医院实验动物中心提供。于24 ℃下适应性喂养1周，12 h昼夜交替，自由饮水及进食。根据随机数字表法分为实验组、正常对照组和逆转组，每组8只。取20 ml CCl4（上海展云化工有限公司）与30 ml橄榄油（山东浩中化工科技有限公司）制成40%的CCl4橄榄油注射液。实验组：实验开始时，皮下注射40%的CCl4橄榄油注射液0.02 ml/g，每周2次，持续4周，于第4周最后1次注射后24 h将小鼠处死，取其肝组织。逆转组：实验开始时，皮下注射40%的CCl4橄榄油注射液0.02 ml/g，每周2次，持续4周，然后给予正常饮食至第8周，第8周末处死小鼠，取其肝组织。正常对照组：以同剂量橄榄油进行皮下注射，每周2次，持续4周，第4周末处死小鼠，取其肝组织。将各组肝组织固定、石蜡包埋以备后续检查。通过HE、Masson染色和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组化结果评估肝纤维化模型成功与否。

1.1.2 HE染色 处死小鼠后，快速取下新鲜肝脏组织块，观察各组大鼠肝脏的形态及颜色变化。将剖取的肝叶投入10%福尔马林溶液，使组织、细胞蛋白质变性、凝固。使用梯度酒精逐渐脱去组织水分，再将组织块置于二甲苯中使组织透明。将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温，后进行包埋。用切片机将包埋好的蜡块切成5 μm薄片。经二甲苯脱蜡，使用梯度酒精水化，采用HE染色（上海歌凡生物科技有限公司）进行处理，显微镜下观察肝细胞变性、坏死及炎性细胞浸润情况。

1.1.3 Masson染色 小鼠肝组织切片用常规方法进行脱蜡、水化，Weigert苏木精液核染5～10 min。水洗后，用1%盐酸乙醇进行分化并快速水洗；而后丽春红酸性品红液染色5～10 min，蒸馏水洗；磷钼酸水溶液处理5 min，苯胺蓝染液染色5 min。经冰醋酸水溶液处理，95%乙醇及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固后，置于显微镜下仔细观察肝脏汇管区胶原纤维沉积量及程度。染色特点：胶原呈蓝色，胞质、肌纤维和红细胞呈红色，胞核呈蓝褐色。采集图像，每个样品选取5个不同的视野拍照。

本研究价值：

NLRC5是免疫反应中重要的调控因子之一，近期研究提示NLRC5参与了多种炎性反应，与肝纤维化的发生紧密相关，但其在肝纤维化中的表达、作用尚不清楚。本研究分析了NLRC5在小鼠肝组织和LX-2细胞中的表达，以揭示NLRC5与肝纤维化及其逆转的关系，结果发现NLRC5在肝纤维化进展及逆转过程中表达有差异。在肝纤维化、活化肝星状细胞（HSC）中NLRC5的表达与正常对照组相比明显增高，而在肝纤维化逆转或失活的HSC中明显降低。此外，NLRC5的敲除促进核因子（NF）-κB信号通路的激活，表明NLRC5是一种通过负调控NF-κB激活HSC的促纤维化分子。抑制NLRC5可能是治疗肝纤维化的一种有效方法。

1.1.4 α-SMA免疫组化 取石蜡切片，室温下二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。柠檬酸热修复15 min后将石蜡切片放入湿盒，用3% H2O2处理10 min以阻断内源性过氧化物酶活性。PBS清洗，加2%胎牛血清白蛋白（BSA）进一步封固。滴加稀释（1∶400）的α-SMA一抗（上海茹创生物科技有限公司）于4 ℃下孵育过夜；复温，PBS洗涤后，将石蜡切片与生物素化的二抗（上海茹创生物科技有限公司）在室温下孵育60 min。通过DAB染色显示α-SMA表达情况。苏木精复染，脱水封固，显微镜下观察纤维化区域内α-SMA阳性区域，切片中阳性细胞可被染成棕黄色颗粒，计算阳性细胞面积占总面积的比例。每个石蜡切片取5个视野。

1.1.5 实时荧光定量PCR 检测小鼠肝组织NLRC5 mRNA水平。

1.1.6 Western blotting法 检测小鼠肝组织NLRC5、磷酸化抑制蛋白α IκBα（P-IκBα）、IκBα、胞质p65、核p65水平。

1.2 体外实验

1.2.1 体外实验建模 采用LX-2细胞株（上海雅吉生物科技有限公司）建立肝纤维化及肝纤维化逆转的体外实验模型，以探究NLRC5在疾病进展、逆转中的作用及可能机制。将LX-2细胞株接种于添加了10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素的DMEM培养基（Gibco公司），并在37 ℃、湿度70%～80%、5% CO2的培养箱中培养。待细胞生长密度达到80%～90%时，用2 ml消化液进行消化，传代培养，将培养的细胞分为三组，建立体外肝纤维化模型及肝纤维化逆转模型〔TGF-β1是刺激HSC活化和分泌细胞外基质（ECM）作用最强的细胞因子，因此本研究采用TGF-β1刺激LX-2细胞以建立肝纤维化模型；MDI可将活化的HSC恢复为失活的HSC，TGF-β1+MDI作为肝纤维化逆转模型〕。TGF-β1组：采用重组人TGF-β1（美国PeproTech公司）10 ng/ml处理细胞，继续培育28 h；对照组：常规培养；TGF-β1+MDI组：采用2.5 ng/ml TGF-β1处理细胞后，PBS清洗3次，采用MDI（0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+1 μM地塞米松+167 nM胰岛素，美国Sigma公司）处理48 h。建模后检测各组LX-2细胞α-SMA、Col1α1及其mRNA水平，高于对照组则表示体外肝纤维化模型建立成功；低于TGF-β1组，接近对照组水平则提示体外肝纤维化逆转模型建立成功。比较三组NLRC5及其mRNA水平。

1.2.2 小干扰RNA（siRNA）转染 NLRC5的特异性、siRNA的设计与合成由上海恒斐生物科技有限公司协助完成。对1.2.1中培养的对数期LX-2细胞进行分组，包括NLRC5-siRNA组、Control-siRNA组及正常细胞组。（1）NLRC5-siRNA组，NLRC5-siRNA正向引物：5'-AAGAACGAGAGACUCUGCCAACUGC dTdT-3'，反向 引 物：5'-GAGAGUUGGCAGAGUCUCUCGUUCUU dTdT-3'。（2）control-siRNA组，NLRC5-siRNA阴 性对照的正向引物：5'-CGUACGCGG AAUACUUCGA-3'；反向引物：5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3'。将对数生长的LX-2细胞培养24 h，根据LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司）说明书，混合稀释的LipofectamineTM 2000和稀释的siRNA寡聚物，孵育20 min。将LipofectamineTM 2000-siRNA寡聚物加入培养基中，轻轻晃动以混合均匀。转染后6 h更换培养基，并以10 ng/ml的浓度添加TGF-β1继续培养48 h。（3）正常细胞组为转染NLRC5-siRNA阴性对照的不添加TGF-β1的正常LX-2细胞。采用Western blotting法及实时荧光定量PCR检测NLRC5和NLRC5 mRNA。

1.2.3 Western blotting法 采用Western blotting法检测各组细胞NLRC5、α-SMA、I型胶原α1（Col1α1）、P-IκBα、IκBα、胞质p65、核p65水平。用含1%PMSF的RIPA缓冲液（北京赛百盛基因技术有限公司）在冰上裂解全细胞蛋白，15 000 r/min离心30 min（离心半径8 cm）收集上清液。根据说明书，使用核蛋白和胞质蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA试剂盒（北京赛百盛基因技术有限公司）测定蛋白浓度。20 μg蛋白质等体积上样，通过10% SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜上。室温下，用5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入稀释的NLRC5一抗、α-SMA一抗、Col1α1一抗、β-actin一抗、IκBα一抗、P-IκBα一抗、胞质p65一抗、核p65一抗（上海歌凡生物科技有限公司），4 ℃过夜孵育。TBST洗3次，加入稀释的HRP标记的二抗（美国Santa Cruz公司），室温下孵育2 h。ECL化学发光试剂盒（北京赛百盛基因技术有限公司）观察，Image J软件分析并计算目的蛋白与内参蛋白之间的灰度比值。

1.2.4 实时荧光定量PCR 采用实时荧光定量PCR检测各组细胞NLRC5、α-SMA、Col1α1 mRNA的含量。使用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）从LX-2细胞中提取总RNA，静置5 min使其完全溶解，将上清液转移至离心管后加入200 μl氯仿，混匀后，孵育2～3 min，4 ℃下12 000 r/min离心15 min（离心半径3 cm），分层取上清液。加入等体积异丙醇，振荡后12 000 r/min离心10 min（离心半径3 cm），弃上清液，收集沉淀。用预冷的75%乙醇清洗，室温下晾干，加入15 μl DEPC溶解，取少量样品检测其ODA260/A280值确保其纯度。参考反转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司）合成cDNA，SYBR Green荧光定量试剂盒（大连宝生物工程有限公司）检测目的基因。PCR反应体系共25 μl，包含1 μl上下游引物（1 μmol/L）、1 μl cDNA产物、2.5μl Taq 10×Buffer、1μl Taq DNA聚合酶、3 μl dNTP混合液，剩余体积用去离子水补充。设置扩增参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，55.5 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环。以β-actin为内参基因，分析各样本Ct值，采用2-ΔΔCt分析目的基因相对表达量。引物序列根据Genbank数据库及Prime 5软件设计，见表1。

表1 实时荧光定量PCR的引物序列Table 1 Prime sequence for quantitative real-time PCR

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件对数据进行分析，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肝组织病理检查结果 大体形态变化：正常对照组小鼠肝脏色泽红润，质地柔软，边缘规则。实验组小鼠肝脏色泽灰暗、表面粗糙、质地较硬，肝组织总体相对肿胀。逆转组小鼠肝脏边缘较规则，部分变锐，表面较为光滑。HE染色结果：正常对照组小鼠肝细胞索排列整齐，无坏死变性、炎性细胞浸润现象。实验组小鼠肝组织存在点状坏死和再生现象，中央静脉周围及汇管区有炎性细胞浸润，可见脂肪变性、气球样变性，部分肝组织结构不清；逆转组小鼠可见肝脏恢复红润，结构趋于正常（见图1）。Masson染色结果：正常对照组小鼠肝小叶结构正常、完整，仅汇管区周围有少许胶原纤维被染成蓝色；与正常对照组相比，实验组小鼠镜下可清晰看到围绕在红色肝细胞团外的蓝色胶原纤维，并大量存在于汇管区；而逆转组胶原纤维增生相比实验组有一定程度的改善（见图2）。三组α-SMA免疫组化阳性细胞比例比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中实验组小鼠肝组织中α-SMA阳性细胞比例高于正常对照组和逆转组，差异有统计学意义（P＜0.05）；逆转组和正常对照组小鼠肝组织中α-SMA阳性细胞比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见图3）。

2.2 小鼠肝组织中NLRC5、NLRC5 mRNA水平 三组小鼠肝组织中NLRC5、NLRC5 mRNA水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中实验组小鼠肝组织中NLRC5、NLRC5 mRNA水平高于正常对照组、逆转组，差异有统计学意义（P＜0.05）；正常对照组NLRC5、NLRC5 mRNA水平低于逆转组，差异有统计学意义（P＜0.05，见图4、表2）。

2.3 小鼠肝内P-IκBα、IκBα、胞质p65及核p65水平 三组小鼠肝组织P-IκBα、胞质p65、核p65水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组小鼠肝组织P-IκBα、核p65水平高于正常对照组及逆转组，胞质p65水平低于正常对照组及逆转组，差异有统计学意义（P＜0.05）；正常对照组P-IκBα、核p65水平低于逆转组，胞质p65水平高于逆转组，差异有统计学意义（P＜0.05）；三组小鼠IκBα水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见图5、表3）。

图1 各组小鼠肝组织HE染色（×200）Figure 1 HE staining of liver tissue in each group of mice

图2 各组小鼠肝组织Masson染色（×200）Figure 2 Masson trichrome staining of liver tissue in each group of mice

图3 各组小鼠肝组织α-SMA免疫组化（×200）Figure 3 Immunohistochemistry of α-SMA in liver tissue of mice in each group

图4 各组小鼠NLRC5蛋白电泳图Figure 4 Electrophoresis of NLRC5 protein in each group of mice

表2 各组小鼠NLRC5、NLRC5 mRNA水平比较（±s）Table 2 The expression level of NLRC5，NLRC5 mRNA in each group of mice

表2 各组小鼠NLRC5、NLRC5 mRNA水平比较（±s）Table 2 The expression level of NLRC5，NLRC5 mRNA in each group of mice

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与实验组比较，bP＜0.05

组别 只数 NLRC5 NLRC5 mRNA正常对照组 8 0.578±0.029 1.000±0.043实验组 8 1.324±0.077a 1.738±0.087a逆转组 8 0.633±0.032ab 1.422±0.073ab F值 3.368 3.764 P值 0.035 0.024

图5 各组小鼠肝组织P-IκBα、IκBα、胞质p65及核p65电泳图Figure 5 Electrophoresis of P-IκBα，IκBα，cytoplasm p65 and nuclear p65 in mouse liver

2.4 LX-2细胞α-SMA、Col1α1及其mRNA水平三组LX-2细胞α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。TGF-β1组LX-2细胞的α-SMA、Col1α1及其mRNA水平均高于对照组、TGF-β1+MDI组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组LX-2细胞的α-SMA、Col1α1及其mRNA水平低于TGF-β1+MDI组，差异有统计学意义（P＜0.05，见图6、表4）。

表3 各组小鼠肝内IκBα、P-IκBα、胞质p65及核p65水平比较（±s）Table 3 Comparison of the levels of IκBα，P-IκBα，cytoplasmic p65 and nuclear p65 in mice of each group

表3 各组小鼠肝内IκBα、P-IκBα、胞质p65及核p65水平比较（±s）Table 3 Comparison of the levels of IκBα，P-IκBα，cytoplasmic p65 and nuclear p65 in mice of each group

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与实验组比较，bP＜0.05

组别 只数 P-I κ B α I κ B α 胞质p 6 5 核p 6 5正常对照组 8 0.1 8 2±0.0 0 9 0.4 3 3±0.0 2 6 0.1 7 5±0.0 0 7 0.3 0 1±0.0 1 2实验组 8 0.3 3 6±0.0 2 0 a 0.4 7 6±0.0 2 9 0.0 9 4±0.0 0 6 a 0.4 8 7±0.0 2 4 a逆转组 8 0.2 7 4±0.0 1 1 ab 0.4 5 0±0.0 2 3 0.1 2 6±0.0 0 7 ab 0.3 6 3±0.0 2 2 ab F值 3.2 6 1 1.8 0 3 3.1 3 7 4.1 5 7 P值 0.0 3 9 0.1 7 4 0.0 4 4 0.0 1 6

图6 各组小鼠α-SMA及Col1α1蛋白电泳图Figure 6 Electrophoresis of α-SMA and Col1α1 protein in each group of mice

2.5 LX-2细胞NLRC5及其mRNA水平 三组LX-2细胞NLRC5及其mRNA水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。TGF-β1组LX-2细胞中NLRC5及其mRNA水平高于对照组、TGF-β1+MDI组，差异有统计学意义（P＜0.05）；TGF-β1+MDI组和对照组LX-2细胞中NLRC5及其mRNA水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05，见图7、表5）。

表4 各组LX-2细胞α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比较（±s）Table 4 Comparison of α-SMA，Col1α1 and mRNA levels of LX-2 cells in each group

表4 各组LX-2细胞α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比较（±s）Table 4 Comparison of α-SMA，Col1α1 and mRNA levels of LX-2 cells in each group

注：与对照组比较，aP＜0.05；与TGF-β1组比较，bP＜0.05

组别 C o l 1 α 1 α-S M A C o l 1 α 1 m R N A α-S M A m R N A对照组 0.8 2 3±0.0 4 1 0.4 1 0±0.0 2 7 1.1 3 1±0.0 4 5 1.1 5 4±0.0 7 2 T G F-β 1组 1.7 2 5±0.1 2 1 a 1.4 1 6±0.0 8 5 a 1 0.9 2 0±0.5 4 6 a 5.3 5 3±0.2 6 8 a T G F-β 1+M D I组 1.3 9 8±0.0 6 9 ab 0.6 4 5±0.0 3 2 ab 4.4 6 9±0.1 7 8 ab 1.2 0 5±0.0 6 1 a b F值 3.6 4 4 4.8 3 6 1 0.9 7 3 7.6 1 9 P 值 0.0 2 7 0.0 0 9 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1

图7 各组细胞NLRC5蛋白电泳图Figure 7 Electrophoresis of NLRC5 protein in each group of cells

表5 各组细胞NLRC5及其mRNA水平（±s）Table 5 The expression level of NLRC5，and NLRC5 mRNA in cells of each group

表5 各组细胞NLRC5及其mRNA水平（±s）Table 5 The expression level of NLRC5，and NLRC5 mRNA in cells of each group

注：与对照组比较，aP＜0.05；与TGF-β1组比较，bP＜0.05

组别 NLRC5 NLRC5 mRNA对照组 1.195±0.060 1.004±0.040 TGF-β1组 2.437±0.122a 1.732±0.087a TGF-β1+MDI组 1.306±0.065ab 1.508±0.075ab F值 3.861 3.256 P值 0.022 0.039

2.6 敲除NLRC5对LX-2细胞中NLRC5表达的影响

NLRC5-siRNA组NLRC5水平（0.679±0.045）低于Control-siRNA组（1.260±0.071），差异有统计学意义（t=11.972，P＜0.001，见图 8）。

图8 siRNA转染后各组细胞NLRC5蛋白的电泳图Figure 8 Electrophoresis of NLRC5 protein in each group of cells after siRNA transfection

2.7 激活LX-2细胞中α-SMA、Col1α1及其mRNA水平 三组激活LX-2细胞中α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。Control-siRNA组、正常细胞组α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；NLRC5-siRNA组α-SMA、Col1α1及其mRNA水平低于Control-siRNA组，高于正常细胞组，差异有统计学意义（P＜0.05，见图9、表6）。

2.8 激活LX-2细胞P-IκBα、IκBα、胞质p65及核p65水平 三组激活LX-2细胞中P-IκBα、胞质p65、核p65水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。NLRC5-siRNA组P-IκBα和核p65水平高于正常细胞组和Control-siRNA组，胞质p65低于正常细胞组和Control-siRNA组，差异有统计学意义（P＜0.05）。三组激活LX-2细胞中IκBα水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见图10、表7）。

图9 siRNA转染后各组细胞α-SMA及Col1α1蛋白的电泳图Figure 9 Electrophoresis of α-SMA and Col1α1 protein in each group of cells after siRNA transfection

表6 各组激活LX-2细胞中α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比较（±s）Table 6 Comparison of α-SMA，Col1α1 and their mRNA levels in activated LX-2 cells in each group

表6 各组激活LX-2细胞中α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比较（±s）Table 6 Comparison of α-SMA，Col1α1 and their mRNA levels in activated LX-2 cells in each group

注：与正常细胞组比较，aP＜0.05；与NLRC5-siRNA组比较，bP＜0.05

组别 Col1α1 α-SMA Col1α1 mRNA α-SMA mRNA正常细胞组 0.780±0.047 0.391±0.022 1.325±0.080 1.243±0.062 NLRC5-siRNA组 1.121±0.056a 0.637±0.034a 6.156±0.308a 2.691±0.135a Control-siRNA 组 1.642±0.082ab 1.326±0.066ab 10.780±0.647ab 5.067±0.203ab F值 5.792 4.268 14.194 11.825 P值 0.004 0.015 ＜0.001 ＜0.001

图10 siRNA转染后各组细胞中IκBα、P-IκBα、胞质p65及核p65蛋白的电泳图Figure 10 Electrophoresis of IκBα，P-IκBα，cytoplasmic p65 and nuclear p65 protein in each group of cells after siRNA transfection

表7 激活LX-2细胞中IκBα、P-IκBα、胞质p65及核p65水平比较（±s）Table 7 Comparison of IκBα，P-IκBα，cytoplasmic p65 and nuclear p65 levels in activated LX-2 cells

表7 激活LX-2细胞中IκBα、P-IκBα、胞质p65及核p65水平比较（±s）Table 7 Comparison of IκBα，P-IκBα，cytoplasmic p65 and nuclear p65 levels in activated LX-2 cells

注：与正常细胞组比较，aP＜0.05；与Control-siRNA组比较，bP＜0.05

组别 P-I κ B α I κ B α 胞质p 6 5 核p 6 5正常细胞组 0.3 7 2±0.0 1 9 1.4 0 3±0.0 8 4 0.4 8 8±0.0 2 4 0.7 3 2±0.3 9 2 C o n t r o l-s i R N A 组 0.8 7 5±0.0 5 3 a 1.4 8 1±0.0 7 4 0.3 1 0±0.0 1 6 a 1.3 6 5±0.0 8 2 a N L R C 5-s i R N A组 1.9 5 5±0.0 9 8 ab 1.3 7 3±0.0 8 2 0.1 9 4±0.0 0 9 ab 1.8 2 6±0.0 9 1 ab F值 6.1 4 1 1.5 1 0 3.3 1 2 8.2 4 9 P值 0.0 0 3 0.2 3 7 0.0 3 7 ＜0.0 0 1

3 讨论

肝纤维化是慢性肝损伤常见的病理变化之一，涉及多类分子、细胞、组织，逐渐进展可导致组织学肝硬化或肝细胞癌，甚至肝衰竭。从病理机制来看，肝纤维化主要是由于ECM蛋白在肝实质中的积聚所致［9］。过度的ECM沉积破坏了肝脏的正常结构，导致肝功能紊乱。在此过程中，HSC的活化对肝纤维化的发生具有重要作用。肝损伤后，HSC被激活并转化为肌成纤维细胞样细胞，表达α-SMA并产生ECM，可促进肝纤维化的形成［10-11］。另外，TGF-β1亦在肝纤维化的发生中起着关键作用，其在受影响器官中的表达持续升高，与ECM沉积增加相关。NLRs在调节HSC功能如细胞增殖、分化和凋亡中起着至关重要的作用，如JIANG等［12］认为NLRP3炎性体可诱导LX-2细胞中TGF-β1和Col1α1的上调，而在硫代乙酰胺诱导的小鼠纤维化模型中，敲除NLRP3可减少胶原蛋白的形成。以上研究提示NLRs对肝纤维化进展的影响不可忽视，需深入研究。NLRC5作为NLRs家族最主要的成员，包含三个结构域，可以调节NF-κB信号通路，识别病原体相关的分子模式（PAMPs）并启动免疫反应。通过调节JAK2/STAT3信号通路，NLRC5能负作用于细胞因子的分泌。更为重要的是，NLRC5是肝纤维化及其逆转的关键调节因子，提示其具有一定的临床应用价值［13］。

许多动物研究及人群研究均表示HSC活化的主要病理生理机制为NF-κB介导的转录激活，NF-κB活性增加可诱导各类炎性因子和黏附分子的表达、分泌，而后者参与肝纤维化的形成［14］。在肝内发生炎症及胶原沉积期间，核内NF-κB会上调促炎细胞因子表达，包括TNF-α、TGF-β1及白介素，通过激活HSC导致纤维化。为了应对肝损伤，HSC被激活并逐渐产生ECM。该过程有多种生长因子参与，其中最为重要的促纤维化因子即是TGF-β1［15］。LIU等［16］研究结果表明，给予TGF-β1刺激，NF-κB活性增加了2倍左右。CHEN等［17］观察到TGF-β1诱导的生长停滞反应下降与转录因子NF-κB的异常激活有关。HAN等［18］证明TGF-β1对活化HSC细胞凋亡的抑制作用涉及NF-κB蛋白表达。上述发现提示TGF-β1和NF-κB之间可能存在串扰，但相关机制及NLRC5在此过程中的作用仍有待进一步研究。

本研究分析了小鼠肝组织和LX-2细胞NLRC5的水平，以揭示NLRC5与肝纤维化及其逆转的关系。本研究结果显示，实验组小鼠肝组织NLRC5及其mRNA水平高于正常对照组、逆转组，体外实验结果显示，TGF-β1组LX-2细胞NLRC5及其mRNA水平高于对照组、TGF-β1+MDI组。以上结果提示NLRC5可能在肝纤维化及其逆转中具有重要作用。在激活的LX-2细胞中使用NLRC5-siRNA后，本研究发现NLRC5-siRNA组α-SMA、Col1α1及其mRNA水 平 低于ControlsiRNA组，高于正常细胞组，提示NLRC5的抑制可以降低纤维化标志物α-SMA和Col1α1的表达，使活化的HSC向静止表型的逆转增加，与相关研究结果一致［19］。

静息状态下，p65亚基与IκB单体结合，位于胞质中，核内缺乏NF-κB。当受到外界刺激时，IκBα发生磷酸化并降解，p65入核并通过经典途径活化NF-κB。本研究结果显示，实验组核p65、P-IκBα及其mRNA水平高于正常对照组及逆转组，且NLRC5-siRNA组核p65、P-IκBα水平高于正常细胞组和control-siRNA组。可见NLRC5-siRNA处理增加了核内p65、P-IκBα水平，提示NLRC5可能是通过负调控NF-κB参与肝纤维化。由于NLRC5在人类和小鼠以及各种细胞类型中具有保守的生物学功能，因此其可能在维持免疫内稳态，特别是在调节先天免疫反应方面起着重要的生理作用。但NLRC5与NF-κB信号通路的具体关系及其在多类疾病中的作用仍不够清晰。根据本研究结果推测，在LX-2细胞中，NLRC5本身是由NF-κB依赖性机制诱导的；TGF-β1的激活增加了P-IκBα的表达，诱导p65从胞质向胞核转移，进而促进了HSC中NLRC5的表达，NLRC5与NF-κB相互作用，促进肝纤维化的发展。本研究局限之处在于，对NF-κB信号通路的研究较浅，相关的细胞因子的探究较少，将在后续实验中进一步完善。

总之，NLRC5可调节TGF-β1诱导的HSC活化和ECM合成，并可以调节和干扰与肝纤维化相关的关键过程，这为临床治疗肝纤维化提供了依据。

作者贡献:张燕进行研究设计与实施、资料收集整理、撰写论文并对文章负责；张燕、范晓翔、章美武进行研究实施、评估、资料收集；庄鲁辉、毛达峰进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。