响应面法优化黄精叶多糖水提工艺

杨朝君， 严 培， 罗 禹， 穆怡含， 刘明坤， 高 平

(1.四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室， 成都 610065; 2.西南医科大学药学院， 泸州 646000； 3.泸州市森奥中药材有限公司， 泸州 646000)

1 引 言

中药黄精(PolygonatumRhizoma)为百合科植物滇黄精(Polygonatumkingianum)、黄精(Polygonatumsibiricum)或多花黄精(Polygonatumcyrtonema)的干燥根茎[1-3]. 主要分布于四川、云南、贵州和陕西等地[4]. 研究表明，黄精中含有多种生物活性成分，如多糖、甾体皂苷、黄酮、植物甾醇、挥发油等[5]. 其中，多糖为黄精中主要药效成分之一，具有降血脂血糖、增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤、耐疲劳、耐缺氧等多种药理作用[6-7]，具有较高医疗保健价值. 目前，大多数的研究主要围绕黄精根部开展，而黄精叶等地上部分却未得到充分开发利用，相关研究也未见报道. 生产实践表明，采集一吨黄精根部药材会产生约400 kg茎叶的副产物，一般做丢弃处理，既浪费资源又污染环境. 因此，为有效提高黄精药材的综合利用价值，获取更大的经济收益，对黄精叶化学成分的相关研究极有必要[8].

目前提取植物多糖的研究中多采用溶剂提法、超声波辅助溶剂提取法、微波辅助溶剂提取法、超声-微波协同提取法、酶解法、超临界流体萃取法等[9-12]. 而溶剂提取法是从植物中提取多糖的常用方法，在所有溶剂中，水是典型的强极性溶剂，对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全被广泛应用[12]. 此外，响应面法[13](Response Surface Methodology，RSM)是一种综合试验设计和数学建模的优化方法,可有效减少试验次数，通过分析响应面图的陡峭程度和等高线图的疏密度，可判别在最优条件下不同变量的取值和所产生交互作用. 在提取试验中RSM应用广泛且高效，Shen等[10]通过RSM法设计优化了云南重楼叶多糖的提取条件，实验收率54.18%；张丽等[14]通过RSM法优化黄精茎秆中总多糖、总皂苷、总黄酮的超声提取工艺；Han等[15]通过RSM法优化了构树多糖最佳提取条件，多糖得率为8.61%.

本实验以黄精叶为研究对象，建立Box-Behnken[16]中心组合设计，首先通过单因素实验得到温度等影响因子的最佳实验值，然后通过模拟二次回归模型，分析提取时间、提取次数、料液比之间的交换作用以及对黄精叶出膏率和多糖得率的影响，从而高效的确定最优提取工艺条件. 本实验对黄精叶多糖进行研究，为研究黄精叶多糖药用价值，提高黄精综合利用率及后续产品的开发提供理论基础.

2 材料与方法

2.1 材 料

2.1.1 实验材料 黄精叶(泸州森奥中药材有限公司)，产地四川泸州市叙永县，为多花黄精. 对照品D-无水葡萄糖(成都植标化纯生物技术有限公司).

2.1.2 试 剂 浓硫酸、乙醇(成都市科隆化学品有限公司)和蒽酮(上海科丰实业有限公司). 所有的化学试剂都是分析级.

2.1.3 仪 器 精密电子天平(BSA124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；机械超声波清洗机(北京科玺世纪科技有限公司)；电热恒温水浴锅(DK-S22，上海精宏实验设备有限公司)；紫外分光光度计721型(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(101-O，上海阳光实验仪器有限公司)；手提式高速万能粉碎机(DFT-200，温岭市林大机械有限公司).

2.2 实验方法

2.2.1 标准曲线绘制 取葡萄糖标准品适量，105 ℃烘干至恒重，精密称定，置于100 mL容量瓶中, 用蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得. 精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置于10 mL具塞刻度试管中，各加蒸馏水水至2.0 mL，摇匀, 在冰水浴中缓慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置水浴中保温10 min，取出，立即置冰水浴中冷却10 min，取出. 以相应试剂为空白，采用紫外-可见分光光度法[17]，在最大吸收波长下测定吸光度.以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线得回归方程为：Y=1.982 3x-0.003 8 (r2=0.9991).结果表明，在此浓度范围内葡萄糖溶液浓度与吸光值呈良好的线性关系，见图1.

2.2.2 黄精多糖的测定 取黄精药材的叶，在40～50℃恒温干燥箱中干燥，粉碎，过40目筛. 精确称重3 g黄精叶粉末，蒸馏水浸提，过滤，精密吸取滤液1 mL，用蒸馏水稀释150倍后，精密吸取0.6 mL至10 mL刻度试管，加蒸馏水补足至2.0 mL，按《中华人民共和国药典》2015版一部(306页)，在582 nm测定吸光度[2]，根据以下公式计算黄精叶多糖含量.

式中：W为黄精叶多糖含量(%)；C为样品溶液多糖质量浓度 (mg/mL)；V为样品定容体积 (mL)；M为原料质量 (g).

2.2.3 单因素试验 影响黄精叶多糖提取的因素很多，其中经预实验，选择提取温度(4、20、40、60、70、80、100 ℃)、提取时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)、液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、40∶1 mL/g).

2.2.4 响应面设计 应用Design-Expert11软件进行 Box-Behnken实验设计，研究分析了提取温度(X1)、提取时间(X2)、液料比(X3)这3个参数之间的相互作用对药材出膏率(Y)、黄精叶多糖得率(K)所产生的影响. 试验因素与水平设计见表1.

表1 响应面因素与水平

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果与分析

3.1.1 提取温度对黄精叶多糖提取率的影响 固定多糖的液料比15∶1，提取时间2.0 h，考察提取温度对多糖提取率的影响，见图2. 随温度升高，在40～70 ℃之间，多糖提取率增加，80 ℃之后，随温度上升提取率有下降趋势. 可能与加温不适影响多糖稳定性有关. 从实验结果及节能方面考虑，选取70 ℃为最佳提取温度.

3.1.2 提取时间对黄精叶多糖提取率的影响 固定多糖的提取温度为70 ℃，液料比15∶1，考察提取时间对多糖提取率的影响，见图3. 在0.5～2.0 h内，多糖提取率与时间的增加成正比，而2.0～3.5 h之间提取率没有明显变化，总体呈下降趋势. 时间的增加可能会导致多糖受热过高降解从而降低多糖提取率，为缩短提取时间节省能耗，提取时间选取1.5 h为宜.

图2 提取温度对黄精叶多糖提取率的影响

Fig.2 The temperature impacts on extracting polysaccharides from leaves of polygonatum

图3 提取时间对黄精叶多糖提取率的影响

Fig.3 The time impacts on extracting polysaccharides from leaves of polygonatum

图4 液料比对黄精叶多糖提取率的影响

Fig.4 The liquid-material ratio impacts on extracting polysaccharides from leaves of polygonatum

3.1.3 液料比对黄精叶多糖提取率的影响 固定多糖的提取温度为70 ℃，提取时间为2.0 h，考察液料比对多糖提取率的影响，见图4. 液料比在5∶1 ～15∶1之间，多糖提取率显著增加，在15∶1～40∶1之间时提取率没有明显变化. 可能由于干燥的黄精叶需吸收较多的水分，待充分浸润后才易于多糖溶出. 因此，从实验结果及节能方面考虑，选择15∶1为最佳液料比.

3.2 黄精叶出膏率Box-Behnken响应面实验设计及实验结果

响应值指标为黄精叶出膏率(Y)，预测值为(Y′)，见表2.

表2 黄精叶出膏率的响应面设计及结果

Tab.2 The design and results of RSM test for extract yield of leaves of polygonatum

序号X1X2X3Y(出膏率,%)Y'(预测值,%)1-1-1042.7542.892-10144.1844.283-10-143.1943.104-11045.6745.5150-1-144.0043.9460-1145.3345.08700047.5047.57800047.2747.57900047.7347.571000047.3747.571100048.0047.571201-145.9746.221301145.5745.63141-1045.8345.991510145.1745.261610-146.0045.901711046.3346.19

表3 黄精叶出膏率的回归模型的方差分析

Tab.3 The variance analysis results of regression mode for extract yield of leaves of polygonatum

来源平方和自由度均方F值P值模型38.4694.2749.62<0.000 1**X17.1117.1182.51<0.000 1**X23.9613.9646.000.000 3**X30.148 510.148 51.720.230 5X1X21.4611.4617.000.004 4**X1X30.828 110.828 19.610.001 73**X2X30.748 210.748 28.690.021 5*X129.5519.55110.84<0.000 1**X223.5913.5941.670.000 3**X328.6518.65100.42<0.00 01**残差0.602 970.086 1--失拟项0.257 630.085 90.994 50.480 8纯误差0.345 340.086 3--总变异39.0716---R20.984 6----Adj R20.964 7----Pred R20.880 7----精密度20.793 2----C.V.%0.645 1----

注：**表示极显著P<0.01;*表示显著P<0.05；R2为判定系数校正值；AdjR2为判定系数预测值； C.V.为变异系数

拟合全变量二次回归方程Y=45.57+0.9425×X1+0.7038×X2+0.1363×X3-0.6050×X1X2-0.4550×X1X3-0.4325×X2X3-1.51×X12-0.9233X22-1.43×X32. 本模型的F值为49.62，P值<0.01，极显著，说明本模型具有显著性；失拟项的P值为0.4808，不显著，说明所建立模型拟合程度好. 相关系数R2=0.9846，AdjR2=0.9647，证明模型的实际值与预测值之间相关性好. 结果表明X1、X2对Y的影响极显著，X3对Y影响不显著. 三因素之间两两的交互作用对Y影响显著，二次项X12、X22、X32对Y极显著. 根据数据方差分析结果，三因素对Y的影响大小排序为X1>X2>X3，见表3.

图5 各因素交互作用对黄精叶多糖出膏率影响

Fig.5 The interaction of various factors impacts on extract yield from leaves of polygonatum

由图5(a)(b)可以看出X1的响应面相对陡峭，等高线较密集，X2和X3的响应面相对平缓，等高线稀疏，说明X1对Y的影响比X2和X3更显著. 由图5(c)可知，X2的响应面相对陡峭，等高线较密集，X3的响应面相对平缓，等高线稀疏，说明X2对Y的影响比X3更显著. 上述结果与方差分析结果(表3)表现一致.

3.3 黄精叶多糖得率

响应值指标为黄精叶多糖得率(K)预测值为(K′)，见表4.

表4 黄精叶多糖得率的响应面分析及结果

Tab.4 RSM analysis and results for polysaccharide yield of leaves of polygonatum

序号X1X2X3K(多糖得率,%)K'(预测值,%)1-1-105.7575.692-1016.2806.373-10-16.2996.344-1106.7256.6650-1-16.2986.3360-115.5505.5370007.1107.1780007.2007.1790007.1807.17100007.2337.17110007.1427.171201-16.4006.42130116.9106.88141-106.1606.22151016.4806.441610-16.9156.82171106.6196.69

对结果进行数据拟合分析，得到拟合全变量二次回归方程K=7.173+0.139 125×X1+0.361 125×X2-0.086 5×X3-0.127 25×X1X2-0.104×X1X3+0.314 5×X2X3-0.326 875×X12-0.530 875X22-0.352 625×X32. 本模型的F值为66.06，P值<0.01，极显著，说明本模型具有显著性；失拟项的P值为0.063 3，不显著，说明所建立模型拟合程度好.R2=0.988 4，AdjR2=0.973 4，证明模型实际值与预测值之间相关性好. 结果表明X1、X3对K的影响极显著，X2对K影响显著. 两两因素的交互作用对K影响显著，二次项X12、X22、X32对K影响极显著. 以上结果表明X1、X2、X3是黄精叶多糖提取过程中的重要影响因素，三个因素对K的影响大小排序为X2>X1>X3，见表5.

由图6(a)可以看出X2的响应面相对陡峭，等高线较密集，X1的响应面相对平缓，等高线稀疏，说明X2对K影响比X1更显著. 同理，由图6(b)可以看出X1的响应面相对陡峭，等高线较密集，X3的响应面相对平缓，等高线稀疏，说明X1对K影响比X3更显著. 由图6(c)可知，响应面最陡峭，表明X2X3交互作用对黄精叶多糖的提取率影响最大. 上述结果与方差分析结果(表5)表现一致.

表5 黄精叶多糖得率参数数学回归分析结果

Tab.5 Results of mathematical regression analysis for polysaccharide yield of leaves of polygonatum

来源平方和自由度均方F值P值模型4.1690.462166.06<0.0001**X10.154 810.154 822.140.002 2**X21.0411.04149.15<0.000 1**X30.059 910.059 98.560.022 2*X1X20.064 810.064 89.260.018 8*X1X30.043 310.043 36.190.041 8*X2X30.395 610.039 5656.560.000 1**X120.449 910.449 964.32<0.000 1**X221.1911.19169.65<0.000 1**X320.523 610.523 674.85<0.000 1**残差0.049 070.007 0--失拟项0.039 730.013 23.760.063 3纯误差0.009 340.002 3--总变异4.2116---R20.988 4----Adj R20.973 4----Pred R20.845 7----精密度25.654 8----C.V.%1.27----

图6 各因素交互作用对黄精叶多糖得率影响的响应面图Fig.6 The interaction of various factors impacts on polysaccharide yield from leaves of polygonatum

4 讨 论

通过以上回归模型的分析, 以黄精叶出膏率以及黄精叶多糖得率为评价指标, 表明在提取过程中，X2是影响多糖提取的关键因素，X1次之，而两个实验指标都同时证明了X3是影响多糖得率最不显著的因素. 在两两交互作用中，X2X3、X1X2的影响是最为显著的，而X1X3的影响是不显著的，推测，时间过长或加热温度不适，会造成多糖结构的破坏，影响多糖提出效果[18-19]. 多糖提取最优工艺参数为：提取温度75.4 ℃、提取时间2.45 h、液料比14.8∶1(mL/g) . 考虑到实际应用过程中操作简便, 将工艺条件修正为：提取温度75℃、提取时间2.5 h、液料比15∶1(mL/g); 在此基础上进行3次平行验证实验，实测药材出膏率为(47.65±0.16)%，与模型预测值47.79%相差不大；实测多糖得率为(7.21±0.073)%，与模型预测黄精叶多糖得率7.24%相差不大. 说明该模型能较好地预测各因素与黄精叶出膏率、多糖得率之间的关系，本实验研究黄精叶多糖提取工艺，为其综合利用开发提供了理论基础，具有应用价值.