小黑杨PsnHB13基因在烟草中的遗传转化与功能分析

肖 迪 刘 轶 李开隆 郑 密 曲冠证

(东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040)

同源异型域——亮氨酸拉链(HD-Zip)蛋白是植物界所特有的一类转录因子，具有结合特异DNA的活性及调控其转录的能力。研究证实HD-Zip蛋白经由亮氨酸拉链形成二聚体，这个二聚体是DNA结合的先决条件，而且该蛋白参与到植物特异性生物过程如光合作用、形态建成等中，在植物的生长发育中扮演重要角色[1]。

目前，在一些植物中已经开展了全基因组范围内的HD-Zip基因家族的鉴定，如拟南芥中鉴定出48个HD-Zip基因[2]，水稻33个[3]，玉米55个[4]，毛果杨63个[5]，小麦46个[6]，棉花61个[7]。可根据HD-Zip基因家族编码基因的内含外显模式、含有除HD-Zip外的其他保守结构域、基因所参与的代谢途径等将HD-Zip分为Ⅰ～Ⅳ四个亚家族[8]。不同亚家族的基因含有的结构域及其编码蛋白的结构均有差异，导致HD-Zip家族基因参与植物不同的发育过程。其中HB13是HD-ZipⅠ亚家族的成员之一，结合生物信息学分析与已有的实验研究[9]，提出了该亚家族蛋白的结构模型：HD-Zip结构域负责结合DNA与二聚体化，AHA结构域负责激活转录，CTR和NTR区域通过控制磷酸化与泛素化对转录激活功能进行调节。同时该亚家族已被鉴定在光信号转导、非生物胁迫、叶片发育等方面发挥重要的作用[10～11]。AtHB13高水平表达可阻止表皮细胞横向扩张，导致转基因拟南芥子叶及叶片的发育改变，即转基因植株中子叶和叶片变得更窄，叶子和叶柄间的连接处不明显等[1]。此外有研究表示，ATHB13在调节糖信号转导中也发挥着作用[4]。HB13基因在不同植物之间的转录调控机制具有保守性[12]，这也为我们在烟草中快速研究该基因的功能提供了有力的理论依据。

杨树被作为木本转基因植物中的模式植物，是目前林木树种遗传转化研究中的典型代表种。小黑杨(Populussimonii×Populusnigra)是中国林业科学院于1959年经小叶杨和黑杨杂交而来[13]。目前，有关杨树HB13基因的功能验证研究鲜有报道。以小黑杨为材料，参考转录数据克隆PsnHB13基因，通过构建植物表达载体并利用农杆菌侵染烟草，获得转基因烟草。发现杨树PsnHB13基因能够导致烟草叶片、根系和花器官等形态发生变化。为进一步开展杨树HB13基因的生理功能研究奠定基础，为杨树生长发育机理的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要试剂

杨树叶片采自东北林业大学校园多年生的小黑杨雄株；普通烟草(NicotianatabacumL.)由本实验室保存；大肠杆菌Trans1-T1感受态购自北京全式金生物技术有限公司；农杆菌菌株GV3101购自上海唯地公司。质粒提取和胶回收试剂盒，购自博日公司；植物表达载体pROKⅡ质粒，由山东师范大学张慧教授惠赠；pEasy-T1载体、EasyPure Plant购自北京全式金生物技术有限公司；PCR相关试剂、DNA Marker、限制性内切酶XbaⅠ、KpnⅠ，DNA Ligation Kit Ver.2.1，TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，PrimeScripTMRT reagent Kit，DNA Fragment Purification Kit，SYBR Premix ExTaqTMⅡ均购自TaKaRa公司(大连)；所用引物合成、测序服务由博仕生物技术有限公司完成(哈尔滨)；其他实验试剂为进口或国产分析纯。

2 实验方法

2.1 目的基因的克隆

参照TaKaRa公司RNA提取试剂盒说明书，提取小黑杨叶片的总RNA。利用Nanodrop 2000分光光度计检测RNA的纯度和浓度，取0.5 μg RNA为材料，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒反转录合成第一链cDNA。根据转录组数据，设计小黑杨PsnHB13基因特异性引物扩增目的片段，所用引物见表1。PCR反应体系为模板2 μL，引物PsnHB13-XbaⅠ-F 1 μL、PsnHB13-KpnⅠ-R 1 μL、10×Buffer 2.5 μL、ExTaq0.25 μL、dNTP 2 μL，用ddH2O补足至25 μL，反应条件为94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 7 min。反应结束后取25 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，选取条带大小正确的进行胶回收。

2.2 植物表达载体的构建及农杆菌转化

用限制性内切酶XbaⅠ和KpnⅠ对胶回收的目的条带和pROKⅡ质粒进行酶切反应。纯化酶切产物并用DNA Ligation Kit进行连接，转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板培养，37℃恒温培养16 h。挑取单克隆进行菌液PCR验证，并将阳性转化子送测序。选择测序成功的菌液保存并提取质粒，利用液氮冻融法将pROKⅡ-PsnHB13质粒转入到农杆菌GV3101感受态细胞内，随机挑取单克隆进行PCR检测，扩增引物pROKⅡ-F和PsnHB13-KpnⅠ-R序列见表1。

2.3 烟草的遗传转化及分子检测

参照本实验室的烟草转化体系进行植物的遗传转化[14～17]。步骤包括：菌液的制备、侵染、共培养、脱菌和分化及生根培养等5部分组成。制备OD600=0.2～0.3的菌液，用菌液侵染切割成1 cm×1 cm大小的烟草叶片，共培养2 d后，在含有40 mg·L-1卡那霉素、400 mg·L-1头孢霉素的分化培养基上培养，培养约21 d后将抗性芽进行抽茎生长，最后转移到生根培养基上进行生根培养。利用CTAB法提取抗性苗叶片DNA，利用引物pROKⅡ-F，PsnHB13-KpnⅠ-R进行PCR反应，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性转基因株系。

表1 本实验中所用的引物

注：下划线:限制性内切酶酶切位点

Note:Underline:Locus of restriction enzyme

2.4 实时荧光定量PCR检测PsnHB13基因表达量

利用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒提取生长30 d的不同转基因株系及野生型烟草幼苗叶片总RNA。以反转录后的cDNA为模板，利用定量引物PsnHB13-RT-F和PsnHB13-RT-R(表1)，参考SYBR Premix ExTaqTMⅡ反应体系，以Ntactin基因为内参基因，进行定量PCR检测。利用2-ΔΔCt法分析定量数据，计算不同株系中PsnHB13基因的相对表达量。

2.5 过表达PsnHB13烟草植株的表型观察

挑选表达量较高3个转基因株系及野生型株系移栽到10×12营养钵中。培养温度26℃，长日照培养，光照时间18 h。培养30 d后，分别选取5株各转基因株系及野生型烟草的第七片叶片(从上到下数)，拍照后使用Image J软件计算叶面积。利用游标卡尺测量叶片的最长长度与宽度，计算长宽比。使用普通光学显微镜对叶片下表皮细胞显微观察，拍照后测量单位面积内细胞数量，使用Image J软件计算细胞平均面积。转基因烟草与野生型烟草在移栽60 d左右均开始开花，7 d后进入盛花期，观察转基因烟草株系与野生型烟草株系同期开放的花朵。

通过转录组得到的PsnHB13基因序列，在TAIR网站(https://www.arabidopsis.org)进行序列比对，发现与AtHB13基因相似度较高，其在TAIR网站的命名为AT1G69780。而AtHB13基因是拟南芥植株幼苗根系生长的负调控因子，可能抑制根系生长。所以为探究PsnHB13是否同样具有该功能则连续筛选4代转基因烟草种子，获得纯合转基因烟草。点种到MS基本培养基中(MS+20 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂，pH5.8)。每7 d测量1次转基因烟草与野生型烟草根长，连续测量5次并记录。

3 结果与分析

3.1 小黑杨PsnHB13基因的克隆及植物表达载体的构建

PsnHB13基因的cDNA长度为870 bp，共编码289个氨基酸(图1)。该基因编码蛋白的分子量为32.99 kDa，蛋白质的等电点为5.94。利用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒提取小黑杨叶片的总RNA(见图2A)。以反转录后的cDNA为模板克隆PsnHB13基因，经琼脂糖凝胶电泳后在900 bp左右处有亮带，条带位置大小正确(见图2B)。PCR产物连接pEasy-T1载体，转化Trans1-T1大肠杆菌感受态后挑取6个单克隆PCR检测，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为阳性单克隆，且条带大小正确。选取3个阳性单克隆测序，测序引物为pROKⅡ-F/R。限制性内切酶XbaⅠ和KpnⅠ同时酶切pEasy-T1-HB13质粒和pROKⅡ质粒，胶回收纯化基因片段酶切产物(见图2C)，使用DNA Fragment Purification Kit试剂盒纯化pROKⅡ质粒酶切产物。用DNA Ligation Kit连接纯化后的基因片段与载体，重组载体暂命名为pROKⅡ-PsnHB13。将连接产物转化入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，随机挑取8个单克隆经pROKⅡ-F/PsnHB13-KpnⅠ-R引物PCR验证，电泳结果均为阳性单克隆，且条带大小正确(见图2D)。提取1#菌液质粒进行双酶切检测(XbaⅠ和KpnⅠ)，电泳后在约900 bp处有亮带，证明成功将PsnHB13基因构建到pROKⅡ载体。并将质粒送公司测序检测。测序结果表明，PsnHB13基因已经重组到pROKⅡ载体上，且没有碱基序列突变，pROKⅡ-PsnHB13载体构建成功。

图2 植物表达载体pROKⅡ-PsnHB13的构建 A.小黑杨叶片总RNA(1～2.小黑杨叶片总RNA)；B.PsnHB13基因的克隆电泳图(1～3.PsnHB13基因的PCR扩增产物，4.ddH2O作为阴性对照)；C.植物表达载体pEasy-T1-PsnHB13的双酶切电泳图(1～3.重组质粒的双酶切产物)；D.农杆菌GV3101转化子的菌液PCR检测电泳图(1～8.不同农杆菌转化子单克隆，9.ddH2O作为阴性对照)；M：DL5000 DNA markerFig.2 The construction of pROKⅡ-PsnHB13 vector A.The total RNA of leaves of Populus simonii×P.nigra; B.The cloning of PsnHB13 gene(1-3.PCR product of PsnHB13 gene; 4.ddH2O as a negative control); C.The double digestion result of plant expression vector pEasy-T1-PsnHB13(1-3.Double digestion of recombinant plasmids); D.PCR detection of Agrobacterium-mediated transformation(1-8.PCR products of transformants in agrobacterium; 9.ddH2O as a negative control); M.DL5000 DNA marker

图3 转基因烟草的获得及PsnHB13基因在烟草中的相对表达量 A.转基因植株的PCR检测(M.DL5000 DNA marker，1.阳性对照，2～14. 13个转基因烟草株系，15.野生型植株，16. ddH2O作为阴性对照)；B.转基因植株的qRT-PCR检测(L1～L13.转基因烟草植株)；C.移栽至土中的转基因植株(CK.野生型植株，L6、L1、L7.不同株系转基因烟草)Fig.3 Acquirement of transgenic tobacco and relative expression level of AtPAP1 gene in tobacco A.Detection of different transgenic tobaccos by PCR(M. DL5000 DNA marker; 1. Positive control; 2-14. Different lines, 15. Wild type; 16. ddH2O as a negative control); B.The qRT-PCR detection of transgenic plants(L1-L13.Transgenic tobacco plants of PsnHB13); C.The mature plant in soil(CK.Wild-type plant; L6,L1,L7.The transgenic plant with target gene)

3.2 pROKⅡ-PsnHB13载体在烟草中的遗传转化与分子检测

采用叶盘转化法，将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经过4～5周的筛选培养，叶片周围的愈伤组织分化出抗性芽。将抗性芽分离后，放在含有卡那抗生素的分化培养基上继代培养，得到大量丛生芽，待丛生芽抽茎后移栽至生根培养基中进行生根培养。提取烟草生根苗幼叶DNA，PCR检测阳性转基因植株。根据检测结果，共得到13个转基因株系(见图3A)。

为了研究小黑杨PsnHB13基因在烟草植株中的表达情况，提取组培烟草生根苗幼叶总RNA，进行荧光定量PCR检测(见图3B)。结果显示，小黑杨PsnHB13基因转化到烟草植株中均有表达，以表达量最低的烟草转基因株系L13中PsnHB13基因表达量为参考，相对表达量最高的株系是L6、L1、L7，这3个株系用于后续实验的观察分析(见图3C)。

3.3 过表达PsnHB13烟草植株的叶片长宽比分析

将表达量较高的3个转基因植株和野生型植株移栽到土壤，14 d后观察叶片形态变化。在营养生长期对烟草成熟叶片进行测量、统计并利用SPSS19.0软件进行统计学差异分析。发现与野生型相比，转基因烟草随着PsnHB13表达量升高叶片长宽比明显增加，叶片变小。单位面积(149 μm×149 μm)内细胞数显著降低，细胞面积增大。与野生型烟草叶片相比，3个高表达转基因烟草株系叶片均显著变小(见图4A)。测量叶片最长长度与宽度，计算长宽比(见图4B)，发现高表达PsnHB13基因的烟草叶片叶型出现变化，与野生型相比，长宽比增加近1.8倍，叶片细长。对3个转基因株系及野生型株系的叶片面积与成熟叶片下表皮细胞显微观察并测量，利用SPSS19.0软件进行统计学差异分析，发现与野生型烟草植株相比，转基因烟草成熟叶片细胞个数明显减少，虽然转基因植株下表皮叶片细胞面积略有增加但未达到显著差异(见图4:C～D)。推测是由于PsnHB13过表达影响叶片细胞增殖数量，细胞数量降低，造成叶片变小。PsnHB13基因表达量最高的株系L7，叶片变小程度最大，出现小叶表型。

图4 野生型和转基因烟草叶片形态学观察与分析 A.烟草叶片面积比较；B.叶片长宽比的比较；C.烟草叶片的细胞数比较；D.烟草叶片的细胞面积比较；CK.野生型植株；L6,L1,L7.转基因烟草株系Fig.4 Microscope observation and analysis of wild type and transgenic tobacco A.Comparison of the leaf area; B.Comparison of the length-width ratio; C.Comparison of the total cell number; D.Comparison of the cell area; CK.Wild type; L6,L1,L7.Individual transgenic plant

图5 野生型和转基因烟草幼苗根系长度的形态学观察与分析 A.烟草早期幼苗根系长度的连续观察；B.第六周的烟草早期幼苗根系长度观察；CK.野生型植株；L1,L7.转基因烟草株系Fig.5 Microscope observation and analysis of wild type and transgenic tobacco A.Continuous observation of the the length of seedling roots; B.Observation of the length of seedling roots at the sixth week; CK.Wild type; L1,L7.Individual transgenic plant

3.4 过表达PsnHB13烟草植株的幼苗根系长度分析

通过对转基因烟草与野生型烟草幼苗时期根系长度连续测量、统计并利用SPSS19.0软件进行差异分析。发现与野生型烟草植株相比，转基因烟草根系生长缓慢。转基因烟草根系长度在第一周测量时与野生型已经开始发生差异，持续到第6周，差异逐渐增大(见图5A)。转基因烟草株系幼苗根系明显短于野生型，生长到第6周时根系长度仅为野生型的1/3左右(见图5B)。可以发现PsnHB13基因的过量表达能够抑制烟草幼苗根系的生长发育。

3.5 过表达PsnHB13烟草植株花的观察

当转基因烟草处于生殖生长期时，发现过表达PsnHB13基因烟草的花出现表型差异。即与野生型相比，高表达的转基因植株花朵整体上均呈现显著变小的差异变化，而且雌蕊较雄蕊生长快(见图6:A～C)，PsnHB13基因高表达烟草无法自花授粉，出现败育现象。

4 讨论

研究发现，HB13基因具有一些保守结构域，如HD-Zip结构域、CTR区、NTR区等。其中HD-Zip结构域负责结合DNA二聚体化，CTR和NTR区域通过控制磷酸化与泛素化对转录激活功能进行调节[10]。其中，关于CTR上AHA结构域的研究比较深入，AHA结构域负责激活转录，该结构域会形成一个带负电荷的两性分子，通过改变蛋白的螺旋结构使其接触基础转录复合物[18]。另外在大麦和豌豆中的研究显示，HB13蛋白的CTR端的保守结构可以增加基因与植物同源域DNA的结合亲和力、影响植物的发育以及育性[19～21]。以往对蛋白结构的研究多集中在其核心结构域，但越来越多的研究显示，其他功能未知的结构可能对蛋白行使功能具有更直接的调节作用，需要更深入的研究探讨。

烟草以其结构简单、相似性高、生长周期短等特点作为模式植物之一，可以弥补杨树生长周期较长这一主要因素，从而可以在短时间内较为真实地验证基因的生理生化功能。本实验在烟草中异源表达小黑杨PsnHB13基因初步探究基因功能。与野生型相比，过量表达PsnHB13的转基因烟草的叶片长宽比明显增加，叶片变小，早期幼苗根系明显变短，植株花朵整体上变小。这可以为推测该基因在杨树中的功能提供一定的参考，该基因可能对杨树的叶型，叶片大小以及根系长度等方面产生影响。

植物叶片是光合作用的主要器官之一，叶片性状特征变化将直接影响到植物的基本行为及生态功能的发挥[22]。近年来，关于叶片性状的研究已逐渐成为植物生态学领域新的研究热点[23]。研究表明，植物单位质量的叶面积越大，生产力就会越高[24]。而根系是植物的主要吸收器官，植物依靠根系从土壤中吸收水分和营养物质[25～26]。能否通过在杨树中敲除或过表达一些基因，使树木在生长发育过程中叶片变大，根系生长加快，提高生产力促进营养生长从而缩短杨树育种周期是个亟待解决的问题。HB13作为一个生长负调控因子，在杨树中敲除该基因，以期获得具有优良性状的优势树种。然而，PsnHB13基因是否是小黑杨生长发育的决定性基因以及通过怎样的方式调控杨树营养器官与生殖器官的发育以及形态变化仍需进一步深入的探究，挖掘其潜在的学术与应用价值。