HPLC法测定果汁和葡萄酒中的三种红色合成色素

吕小丽，朱春燕，陈林，郭平*

1. 江西省食品检验检测研究院（南昌 330001）；2. 赣州市全标生物科技有限公司（赣州 341100）

合成色素多由苯、甲苯等为原料合成，往往含有重氮、苯环、氧杂蒽等结构，对人体存在致癌等隐患[1]。目前，国际上允许使用的合成着色剂已由过去的上百种降至二十余种，如美国只批准使用7种，日本也只有11种[2]。但目前在很多国家和地区，合成色素并没有被完全禁止使用，因此对合成色素的检测仍然是食品检测的一个重点[3]。

目前报道的对食品中色素的检测方法主要有高效液相色谱法[5-8]、高效液相色谱-质谱-质谱法[9-10]、表面增强拉曼光谱法[11]、毛细管电泳法[12]和免疫PCR法[13]等。但是已报道的对果汁和葡萄酒中着色剂的检测多限于柠檬黄、诱惑红、日落黄等常见色素的检测，而对于同时测定果汁和葡萄酒中的赤藓红、荧光桃红和孟加拉玫瑰红这三种红色色素的研究较少，并且这些检测方法的样品净化过程一般都采用聚酰胺吸附法或是直接稀释法等，它们具有操作费时繁琐、有机试剂消耗量大、基质干扰严重、回收率低等特点。鉴于此，试验采用弱阴离子固相萃取小柱对样品进行前处理，基于高效液相色谱（HPLC）分离技术，对赤藓红、孟加拉玫瑰红和荧光桃红3种色素进行检测。该方法分离度高、基质干扰小、灵敏度高、快速准确，可为果汁和葡萄酒中非法添加或超标添加的合成色素的快速准确检测提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪，配DAD检测器（美国Agilent公司）；Vortex-Genie2涡旋混匀器（美国Scientific Industries公司）；KQ.600B超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）；R-215旋转浓缩仪（瑞士BUCHI公司）；N-EVAP氮吹仪（美国Organomation公司）；G-16高速离心机（德国Sartorius公司）。

1.2 材料与试剂

乙腈、甲醇、乙酸铵均为色谱纯；氨水、乙酸为分析纯；水为Millipore超纯水；标准品：赤藓红（Erythrosine），CAS登录号16423-68-0，纯度≥90%；荧光桃红（Phloxine B），CAS登录号18472-87-2，纯度≥90%；孟加拉玫瑰红（Rose bengal），CAS登录号632-69-9，纯度≥90%；弱阴离子固相萃取柱为Strata X-AW SPE（6 mL，200 mg），使用前依次用6 mL甲醇和6 mL水活化。

1.3 标准溶液制备

标准储备液（1.0 mg/mL）：准确称取适量（10.00 mg左右）的赤藓红、孟加拉玫瑰红和荧光桃红标准品，分别用甲醇溶解并定容至10 mL，在-18 ℃以下避光保存。

混合标准中间溶液：取一定量的上述标准储备液，混合，用甲醇将浓度稀释至50.0 μg/mL混标，在-18 ℃以下避光保存。

标准工作液：临用前取适量上述混合标准中间液，用50%甲醇溶液稀释至0.25，0.50，1.0，2.0，5.0和10.0 μg/mL标准工作液。

1.4 样品来源

果汁和葡萄酒样品均为市售样品。

1.5 液相色谱条件

色谱柱：Agilent Z0RBAX SB C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）；流动相：乙腈-0.04 mol/L乙酸铵；梯度洗脱，洗脱程序见表1。流速1.0 mL/min，柱温30℃，进样体积20 μL，波长540 nm。

σ收敛是指不同经济体间某一变量值的标准差随时间的推移而逐渐下降，用来反映该变量值的平均离散程度。本文基于标准差的估计方程理论，构建地价、房价和物价的σ收敛模型，分析35个大中城市的地价、房价和物价的静态差距。σ收敛检验方程为：

表1 HPLC梯度洗脱条件

1.6 样品前处理方法

1.6.1 提取

称取2 g（精确到0.01 g）试样于50 mL离心管中，加入10 mL 1%氨水-甲醇（1∶1，V/V）溶液，混匀，超声提取10 min，用10%乙酸调pH约6.0，待净化。

1.6.2 净化

将所得待净化溶液全部转移至活化好的弱阴离子固相萃取柱中，再依次用6 mL 0.02 mol/L乙酸铵溶液、6 mL 80%甲醇溶液淋洗小柱，弃去淋洗液，用10 mL 10%氨水-甲醇（1∶1，V/V）溶液进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液先旋蒸再于50 ℃下氮气吹至0.5 mL左右，加50%甲醇定容至2.0 mL，超声2 min，混匀后，于14 000 r/min离心10.0 min，取上清液，供高效液相色谱仪测定。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

将赤藓红、孟加拉玫瑰红和荧光桃红标准物质用50%甲醇溶液分别配制成10.0 μg/mL的标准溶液，用二极管阵列检测器在300～800 nm范围扫描。赤藓红最大吸收波长为530 nm，荧光桃红最大吸收波长为546 nm，孟加拉玫瑰红最大吸收波长为556 nm。当波长为530 nm时，赤藓红响应值为22.5 mAU，荧光桃红响应值为26 mAU，孟加拉玫瑰红响应值为21 mAU；当波长为540 nm时，赤藓红响应值为14.5 mAU，荧光桃红响应值为38 mAU，孟加拉玫瑰红响应值为39 mAU；当波长为550 nm时，赤藓红响应值为4 mAU，荧光桃红响应值为78 mAU，孟加拉玫瑰红响应值为39 mAU；综合考虑三者情况，最终选择540 nm为检测波长。

2.2 色谱柱的选择

赤藓红、荧光桃红和孟加拉玫瑰红均为水溶性物质，极性较强，色谱柱类型应选反相色谱柱，试验使用了三种不同类型的C18柱对三种色素进行分离，分别是Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）、Waters Xbridge C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）和Waters SunFire C18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）。

结果显示：采用Waters Xbridge C18色谱柱，三种物质的峰形都有明显的拖尾现象；在Waters SunFire C18色谱柱中，孟加拉玫瑰红的峰形有略微拖尾，且三种物质在该柱子上的响应值没有Agilent ZORBAX SB C18柱的高，因此最终选择的色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）。

2.3 样品前处理条件的选择

2.3.1 直接稀释法测定与SPE柱净化法比较

文献[14-15]报道，测定葡萄酒和果汁中色素时，可直接稀释测定，同时随着现代固相萃相技术的普及，色素的净化方式也可采用固相萃取柱净化，根据赤藓红、荧光桃红和孟加拉玫瑰红三种色素的化学结构式，适合用弱阴离子交换柱对其进行净化。取5.0 g阴性的葡萄酒试样和5.0 g阴性的果汁试样，添加三种色素混标，添加量为10.0 μg/g，再用水定容至25 mL。混匀后，离心5 min，用高效液相色谱法测定，再取5.0 g阴性的葡萄酒试样和5.0 g阴性的果汁试样，添加三种色素混标，添加量为10.0 μg/g，调pH至6.0，过X-AW柱后，浓缩、定容后用高效液相色谱法测定。果汁和葡萄酒试样中的赤藓红、荧光桃红、孟加拉玫瑰红的直接稀释法测定与SPE柱净化后测定结果见表2。果汁和葡萄酒用直接稀释法测定时，因样品无净化过程，回收率偏低，而果汁和葡萄酒中赤藓红、荧光桃红、孟加拉玫瑰红用X-AW柱净化后，回收率明显提高。故选用弱阴离子交换固相萃取柱对样品提取溶液进行净化。

表2 直接稀释法测定与SPE柱净化法测定结果比较

2.3.2 提取溶液的选择

分别取两份10.0 g阴性的葡萄酒试样和10.0 g阴性的果汁试样，添加待测物，使其浓度为0.1 μg/g，分别加入10 mL水和10 mL甲醇-1.0%氨水（1+1），超声10.0 min，用10%乙酸调pH至6.0，过X-AW柱，浓缩、定容后用高效液相色谱法测定。果汁和葡萄酒样品中的赤藓红、荧光桃红、孟加拉玫瑰红用水和甲醇-1.0%氨水（1+1）提取的结果见表3。果汁和葡萄酒中的赤藓红、荧光桃红、孟加拉玫瑰红用甲醇-1%氨水（1+1）提取，其回收率明显比用水提取的高。因此选择甲醇-1%氨水（1+1）溶液作为提取溶剂。

表3 不同提取溶液的提取效果结果比较

2.3.3 上机前过膜与高速离心效果比较

考虑到微孔滤膜可能对色素会有吸附作用，试验比较了上机前过膜或高速离心的方式对三种色素的影响。取两份质量浓度为1.0 μg/mL的混标。体积为1 mL，一份高速离心后上机检测，一份过膜后上机检测，结果如表4所示。过膜对三种待测物有影响，其中对孟加拉玫瑰红的影响最大，其回收率下降近50%，说明滤膜会对色素有吸附，导致回收率下降。故采用高速离心后上机检测。

2.4 方法学验证

2.4.1 方法线性范围和定量限

取50 μg/mL混合标准储备液，用50%甲醇溶液逐级稀释至0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0和10.0 μg/mL七个浓度。按照上述色谱条件进样，以各物峰面积Y对质量浓度X（μg/mL）进行线性回归分析，以峰面积（Y）对浓度（X，μg/mL）绘制标准曲线，标准谱图见图1，线性关系和相关系数见表5。

由表5可知，赤藓红、荧光桃红和孟加拉玫瑰红在0.1～10.0 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。当添加水平为0.50 mg/kg时，信噪比（S/N）大于10，可满足定量检测要求，因此确定方法的定量限为0.50 mg/kg。

表4 离心与过膜试验对比

图1 三种混标图谱

表5 标准曲线方程及线性回归系数

2.4.2 回收率和精密度

采用向阴性样品中添加待测物的方式进行方法学评估。以不含赤藓红、荧光桃红、孟加拉玫瑰红色素的果汁、葡萄酒为空白样品基质，添加0.5，1.0和2.0 mg/kg三个浓度水平，每个浓度水平进行10次重复试验，测得的赤藓红、荧光桃红、孟加拉玫瑰红的回收率和精密度见表6。回收率在86.56%～101.90%之间，相对标准偏差在2.07%～6.44%之间，符合残留检测的要求，可见该法回收率高、稳定性强、重复性好。

3 结论

试验建立了一种同时测定果汁和葡萄酒中赤藓红、荧光桃红和孟加拉玫瑰红三种红色色素的高效液相色谱法，并确定了前处理条件和色谱条件。样品用1%氨水-甲醇溶液（1+1）超声提取，经弱阴离子固相萃取柱净化后，用高效液相色谱仪测定。结果显示：赤藓红、荧光桃红和孟加拉玫瑰红在0.1～10.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数R2＞0.999 9。各色素在0.5，1.0和2.0 mg/kg的样品加标条件下回收率为86.56%～101.90%，相对标准偏差为2.07%～6.44%。该方法具有前处理简便、快速、重现性好等优点，可用于果汁和葡萄酒中赤藓红、荧光桃红和孟加拉玫瑰红的测定。