不同剂量天葵颗粒对肾虚血瘀型子宫内膜容受性不良模型大鼠血清性激素、VEGF、ITG-β3及胚胎着床影响

李虹秀 毛 惠 吴 敏

1.西南医科大学(泸州，646000);2.西南医科大学附属中医医院

子宫内膜在胚胎着床及妊娠过程中均发挥重要作用，其容受性决定着接受胚胎着床的能力[1]。近年来我国育龄女性的不孕症发生率呈上升趋势[2]，虽然大部分不孕症是排卵障碍导致[3]，但子宫内膜容受性不良也会引起不孕症[4]。西药虽然在治疗促排卵疗效较显著，但可能会引起肝肾功能损伤[5]。中医认为，女子以血为本，气滞血瘀、瘀阻冲任、气血运行受阻则种子艰难，因此补肾填精、益气养血活血是治疗子宫内膜容受性不良的关键[6]。天葵颗粒是根据《医学衷中参西录》寿胎丸加减而成的温肾活血颗粒剂，在治疗排卵障碍性不孕症方面有很好疗效[7]，但在子宫内膜容受性不良引起的不孕症治疗的相关研究较少。因此本研究通过建立肾虚血瘀型子宫内膜容受性不良模型大鼠，用不同剂量的天葵颗粒进行治疗，观察其对内膜病理结构、孕激素水平、子宫着床胚泡数及子宫体血供情况。

1 材料与仪器

1.1 实验动物来源

选取SPF级性成熟雌性SD大鼠96只，体重200～220 g；同品系成年雄性大鼠48只，体重250～280 g，均购于成都达硕，合格证号[SCXK(川)2015-030]。雌、雄大鼠于实验前1周购入适应性饲养，雌雄分笼饲养于本校实验动物中心动物房[SYXK(川)2018-065]。培育室温度20～25℃，湿度65%～70%，人工光照(12 h/昼、12 h/夜)，大鼠全天自由饮水，常规饲料饲养。实验过程均严格遵循“3R”原则。

1.2 主要试剂与仪器

天葵颗粒(西南医科大学附属中医医院制剂室提供，川药制字：Z20080326)；戊酸雌二醇片(补佳乐，DELPHARMLille S.A.S.制药，H20080108)；羟基脲片(齐鲁制药有限公司生产，H37021289)；盐酸肾上腺素注射液(天津金耀氨基酸有限公司，H12020526)；雌激素(E2)、孕酮(P)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(茁彩生产)；兔抗大鼠血管内皮生长因子(VEGF)多克隆抗体(北京博奥森生物科技有限公司)；兔抗大鼠整合素-β3(ITG-β3)多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；二抗及相应试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；转轮式切片机(徕卡-2016，德国)；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-Ⅲ型包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)；数码三目摄像显微镜(BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)；图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics公司)。

1.3 实验方法

1.3.1动物分组大鼠适应性饲养1周后，每日清晨行阴道涂片，以动情期规律为入组标准筛选96只大鼠，按随机数字表分组法分为6组：空白组、模型组、天葵颗粒低、中、高剂量组、补佳乐组，每组16只。

1.3.2造模及给药参照文献[8]造模方法建立肾虚血瘀模型。除空白组外各组每天按照450 mg/kg上午灌服造模药羟基脲，下午灌服受试药物，第4 d开始加用肾上腺素0.104 mg/kg/d皮下注射7 d。天葵颗粒低、中、高剂量组分别给予3.125、6.25、12.5 g/kg中药悬混液0.5 ml灌胃(相当成人等效剂量、2倍、4倍等效剂量)，补佳乐组灌服0.3 mg/kg的戊酸雌二醇片，1次/d，空白组和模型组给予等量生理盐水，连续10 d。造模结束后，各组大鼠每日18：00按雌雄2：1合笼，第2 d 8：00行阴道涂片观察，发现精栓则计为妊娠第1 d，分别于妊娠第5、8 d 9:00，各组随机抽取8只，用10%水合氯醛麻醉后取腹主动脉血液，断头处死后剖离子宫体。

1.4 检测项目

妊娠第5天：①将腹主动脉血液离心取上清，ELISA法检测E2、P水平；②将剥离的子宫体甲醛固定，石蜡包埋制成切片，常规HE染色，光镜下观察内膜组织形态学变化与子宫内膜血管分布情况，采用图像分析软件Motic Images Advanced 3.2测量计数血管数；③采用免疫组化处理子宫切片，光镜下观察切片，检测阳性细胞呈黄色或棕黄色。采用Image-Pro Plus 6.0对每个组织的400倍下3张照片进行光密度值分析，测定子宫内膜VEGF及ITGβ3的表达量，得出每个视野的平均光密度值(平均光密度值与VEGF和KDR的表达量成正比)。妊娠第8天：计数孕鼠数及着床卵泡数。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况观察

空白组大鼠一般情况良好，毛色光滑，反应灵活，体质量呈稳步增长，大便正常；模型组大鼠出现拱背，蜷缩少动，反应迟钝，皮毛疏松毛躁、脱毛，大便偏稀，甚至便溏等；补佳乐组和天葵颗粒高剂量组一般情况与空白组类似，天葵颗粒中、低剂量组大鼠一般情况介于空白组与模型组之间。

2.2 大鼠子宫内膜病理及血管数变化

HE染色结果显示：空白组大鼠妊娠第5d时子宫内膜组织内膜、肌层和外膜结构清晰，子宫内膜较为完整，子宫腺上皮细胞形态正常，胞核大而圆，核仁明显，子宫腺未见明显扩张，肌层肌纤维平行排列，整齐、致密；浆膜层单层间皮细胞及薄层疏松结缔组织结构完整清晰，血管丰富。与空白组相比，模型组大鼠子宫内膜增生，见内膜增厚，细胞成分明显增多，少量子宫内膜上皮细胞坏死，见胞质空泡化，胞核溶解；子宫腺短、直而细、排列稀疏，子宫腺上皮细胞坏死，固有层间质内极少量至少量炎细胞浸润，以淋巴细胞为主，血管数量明显减少(P<0.001)。与模型组比较，天葵颗粒高、中剂量组、补佳乐组大鼠子宫内膜、肌层和外膜结构清晰，子宫内膜较为完整，部分子宫内膜上皮细胞空泡变性；固有层内含子宫腺，腺上皮细胞排列规则，子宫腺未见明显扩张，固有层间质内少量或极少量炎细胞浸润，包括淋巴细胞和少量中性粒细胞；肌层肌纤维平行排列，整齐、致密；浆膜层单层间皮细胞及薄层疏松结缔组织结构完整清晰，内膜组织血管增加(P<0.001)。见图1(见插页)、表1。

2.3 大鼠血清激素水平变化

妊娠第5 d时，与空白组相比，模型组大鼠血清E2、P水平降低，补佳乐和高、中剂量组血清E2、P水平升高(P<0.001)。见表1。

表1 各组大鼠各观察指标比较(n=8)

2.4 大鼠子宫内膜组织中VEGF、ITG-β3表达变化

免疫组化结果显示，VEGF空白组中可见大量褐色细胞，VEGF阳性表达率高；ITG-β3空白组部分染成褐色细胞，而模型组中VEGF及ITG-β3褐色细胞数目减少，补佳乐及不同剂量天葵颗粒组褐色细胞数明显增多，且与天葵颗粒呈剂量依赖；妊娠第5天时，与空白组相比，模型组VEGF、ITG-β3平均光密度降低，补佳乐和高、中、低剂量天葵颗粒剂量组VEGF、ITG-β3平均光密度高于模型组(P<0.01)。见图2、3(见插页)，表1。

2.5 大鼠妊娠及胚泡着床变化

妊娠第8 d时，对各组大鼠胚泡着床肉眼观察发现，空白组子宫着床胚泡数较多，胚泡呈串珠状隆起，两侧子宫胚泡大小、数量均匀，子宫体红润，血供佳；模型组子宫着床胚泡数较少，分布稀疏，胚泡体积小于空白组，可见被吸收胚泡的痕迹，子宫体苍白，血供差；天葵颗粒高、中剂量及补佳乐组胚泡着床数大于模型组，两侧子宫胚泡大小、数量较均匀，血供尚可。各组大鼠的着床率无差异(P>0.05)，与空白组相比，模型组着床胚泡数降低，补佳乐和天葵颗粒高、中、低剂量天葵颗粒组着床胚泡数高于模型组(P<0.01)。见图4(见插页)，表1。

3 讨论

西药促排卵往往会使患者激素代谢紊乱，降低子宫内膜容受性，引起妊娠率下降[9]。中医没有“子宫内膜容受性”的相关记载，但子宫内膜容受性不良在临床多表现为不孕，中医以“肾-天癸-冲任-胞宫”调节轴来反应女性的生殖情况[10]，肾乃先天之本，主藏精，生天癸，主生殖，为冲任之本，孕胎之根，如果肾气虚弱，早配频产，引起精血耗伤，外加七情内伤，导致气滞血瘀，淤滞冲任，更难摄精受孕。随着医学研究的深入，发现不管是肾阴虚还是肾阳虚均会引起血瘀型的病理表现[11]。本研究建立了符合中医特征的肾虚血瘀型子宫内膜容受性不良大鼠模型，其子宫内膜病理组织切片结果显示，细胞成分明显增多，少量上皮细胞死亡，且胞质空泡化、核膜溶解较多，最主要是血管数量显著减少，且子宫内膜组织中VEGF阳性表达率也显著降低；而经过中、高剂量的天葵颗粒处理后，子宫内膜组织结构与空白组基本一致，且血管数量增多，子宫内膜组织中VEGF阳性表达率升高。子宫内膜中血管数量减少及血供不足均引起子宫内膜容受性降低，可能与天葵颗粒中主要成分淫羊藿和红花有关。现代药理学证实，淫羊藿中的黄酮甙具有扩张外周血管的功能[12]，而红花中的黄色素可以改善血液微循环[13]，二者均有利于缓解模型大鼠子宫内膜血管数量减少及血运不足等情况。

孕激素是影响子宫内膜分泌功能、诱导内膜蜕膜化及允许胚胎植入的最主要因素之一[14]。子宫内膜的发育必须与卵泡发育、排卵同步进行才具备胚胎植入能力，当机体受孕后，其血清中E2及P均升高，促进子宫肌细胞增生肥大，增进血运，为妊娠最好准备[15]；ITG-β3通常会在着床期开放时在子宫内膜腺上皮及子宫内膜上皮中高表达，促进孕卵着床[16]。本研究结果显示，模型组大鼠血清E2、P水平降低，子宫内膜ITG-β3阳性表达率降低，中、高剂量天葵颗粒处理组血清E2、P水平升高，子宫内膜ITG-β3阳性表达率升高，这可能是因为孕激素水平较低，无法刺激ITG-β3的表达，不利于孕卵着床；而天葵颗粒中的主要成分菟丝子、桑寄生等具有加强垂体-卵巢促黄体功能，还可以诱导雌激素样活化促进子宫发育[17-18]。本研究对胚泡着床肉眼观察到，模型组着床胚泡数较少，且分布较稀疏，且胚泡吸收痕迹明显，子宫体颜色苍白血供不足，天葵颗粒治疗组子宫着床胚泡数增多，且呈现剂量关系，血供与对照组相似，证实天葵颗粒具有的温肾活血之功效。

综上所述，肾虚血瘀作为无排卵障碍性不孕症的主要病机，温肾活血是治疗根本。天葵颗粒可能是通过上调VEGF表达促进子宫内膜血管生长而改善子宫内膜血供同时促进E2、P等激素合成，上调ITG-β3表达，促进着床窗开放，提高孕卵着床率，最终发挥调经助孕之功效。