右美托咪定对布比卡因抑制大鼠心室肌细胞钠电流的影响研究

陈鸿飞 金周晟 夏芳芳 蔡瑶瑶 刘乐

布比卡因是酰胺类局部麻醉药之一，其镇痛效果好、作用时间长，在临床麻醉有一定应用前景。但是布比卡因误入血管可引发心律失常甚至心脏停搏，其毒性得到广泛关注[1-6]。右美托咪定是常用于区域阻滞的镇静药物和局部麻醉药物的辅佐药，具有较强的镇静和延长局部麻醉药镇痛时间的效果[7-8]。有研究表明右美托咪定可增强大鼠对布比卡因的耐受力，但具体机制尚不明确[9]。布比卡因的心脏毒性主要由心肌细胞钠通道被阻滞引起[10]，目前鲜有右美托咪定对布比卡因抑制心肌细胞钠电流（sodium current，INa）影响的研究。本研究观察右美托咪定对布比卡因抑制的大鼠心室肌细胞INa的影响，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择雄性SD大鼠（动物许可号SYXK 2015-009）5 只，鼠龄 8～9 周，体重 275～310 g。由温州医科大学实验动物中心供应，饲养于温州医科大学动物中心屏障环境。本研究经温州医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 试剂和配方 试剂：牛血清白蛋白、二甲基亚砜、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid,HEPES）、乙二醇双四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA）、氯化铯、谷氨酸、牛磺酸、氯化钙、镁ATP和氢氧化铯购于美国Sigma试剂公司。布比卡因粉剂（批号:BCBM7058V）购于美国Sigma试剂公司，注射用盐酸右美托咪定（批号：190428BP）由江苏恒瑞制药有限公司提供。台氏液配方：氯化钠137 mmol/L、氯化钾5.4 mmol/L、氯化钙1.8 mmol/L、氯化镁1.0 mmol/L、磷酸二氢钠0.33 mmol/L、HEPES10 mmol/L、葡萄糖 10 mmol/L，氢氧化钠调pH至7.4±0.5，无钙台氏液为台氏液中去除氯化钙。KB（kraft-bruhe solution，KB）液配方：氯化钾 40 mmol/L、磷酸二氢钾 20 mmol/L、硫酸镁3.0 mmol/L、氢氧化钾 80 mmol/L、谷氨酸 50 mmol/L、牛磺酸 20 mmol/L、HEPES10 mmol/L、葡萄糖 10 mmol/L、EGTA0.5 mmol/L，氢氧化钾调pH至7.4±0.5。细胞外液配方：氯化胆碱140 mmol/L、氯化钠20 mmol/L、氯化镁1.0 mmol/L、HEPES 5.0 mmol/L、葡萄糖 10 mmol/L、氯化铯4.6 mmol/L，氢氧化铯调pH至7.4±0.5。电极内液配方：氯化铯120 mmol/L、氢氧化钠10 mmol/L、氯化镁1.0 mmol/L、 钠 ATP 5.0 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L，氢氧化铯调pH至7.3±0.5。所有液体使用前均采用95%O2和5%CO2混合气体预充15 min。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心室肌细胞分离[11-12]采用腹腔注射80 mg/kg盐酸氯胺酮和12 mg/kg甲苯噻嗪进行麻醉，腹腔注射500 U/kg肝素防止冠状动脉内微血栓形成。大鼠无反射后以断头法处死，然后剪下心脏置于4℃台氏液，立即分离主动脉，然后连接到Langendorff离体心脏灌流系统进行灌流。维持温度为36～37℃，流速为10～12 ml/min。先采用无钙台氏液灌流3 min以去除离体心脏中的血液，然后在30 ml无钙台氏液中加入Ⅰ型胶原酶（1 mg/ml）、ⅤⅠⅩ型蛋白酶（0.05 mg/ml）和氯化钙（50 μmol/l）进行循环灌流10 min。随后剪下左心室部分，剪成约1 mm3碎片置入KB液中，用塑料滴管轻轻吹打3 min，使其分离成单心室肌细胞。采用100目微孔滤膜过滤后，留取含心室肌细胞的滤液，静置1 h后进行全细胞膜片钳技术实验。

1.2.2 分组和灌流方案 建立Langendorff模型灌流酶解获得心室肌细胞32个，采用随机数字表法分为4组：Bupi组、Dex组、Bupi+Dex组和空白对照组，每组8个心室肌细胞。Bupi组细胞灌流含布比卡因（50 μmol/l）的细胞外液；Dex组细胞灌流含右美托咪定（50 ng/ml）的细胞外液；Bupi+Dex组细胞灌流含布比卡因（50 μmol/L）复合右美托咪定（50 ng/ml）的细胞外液；空白对照组细胞灌流空白细胞外液。

1.2.3 全细胞膜片钳技术记录INa采用德国HEKA公司的EPC 10膜片钳放大器进行电流记录，电压刺激信号和电流采集由德国HEKA公司pulse 8.0软件完成。采用微电极拉制仪完成玻璃电极的拉制，尖端直径1～1.5 μm，入液后电阻1.0～2.5 MΩ。为排除钾离子对INa的记录影响，电极内液和细胞外液的氯化钾由氯化铯代替。为了减少钳位误差，将细胞外液中的氯化钠浓度控制为20 mmol/L，氯化胆碱为140 mmol/L，以维持细胞内外渗透压的平衡。当心室肌细胞和电极形成稳定的封接后，开始记录电流。记录4组大鼠心室肌细胞以下指标：（1）灌流前后的INa峰值，其中INa基础峰值为灌流前测定的INa的峰值，INa灌流后峰值为灌流后稳定5 min测定INa的峰值。电流峰值采用电流密度表示，电流密度 = 电流值（nA）/细胞电容（pF）。（2）灌流后INa原始电流图。（3）计算INa峰值抑制值，INa峰值抑制值 =（INa灌流后峰值/INa基础峰值）×100。（4）灌流前后的INa的I-V曲线。刺激参数：钳制电位-90 mV，电位从-90 mV逐步上升为+50 mV，电位阶跃10 mV，刺激波宽为10 ms，刺激频率0.2 Hz。根据4组I-V曲线得出大鼠心室肌细胞INa的激活电位和反转电位，其中出现INa峰值的膜电位为峰值电位，开始激活INa时的膜电位为激活电位，INa值为零时的膜电位为反转电位。

1．3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。采用Origin 8.0软件对测量后的数据进行绘图。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠心室肌细胞灌流前后INa峰值的比较见表1。

表1 4组大鼠心室肌细胞灌流前后INa峰值的比较

由表1可见，灌流前，4组大鼠心室肌细胞的INa基础峰值比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。灌流后，Bupi组、Dex组和Bupi+Dex组的INa灌流后峰值均低于空白对照组，Dex组、Bupi+Dex组灌流后峰值均高于Bupi组，Bupi+Dex组的INa灌流后峰值低于Dex组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.2 4组大鼠心室肌细胞灌流后INa原始电流图 见图1。

图1 4组大鼠心室肌细胞灌流后INa原始电流图

由图1可见，空白对照组的灌流后INa峰值高于其他3组。同时，Bupi组灌流后INa峰值在4组中最低，其次为Bupi+Dex组。

2.3 4组大鼠心室肌细胞INa峰值抑制值的比较 见图2。

图2 4组大鼠心室肌细胞INa峰值抑制值的比较

由图2可见，灌流后，Bupi组、Dex组和Bupi+Dex组的INa峰值抑制值均高于空白对照组，Dex组和Bupi+Dex组的INa峰值抑制值低于Bupi组，Bupi+Dex组的INa峰值抑制值高于Dex组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.4 4组大鼠心室肌细胞灌流后INa的I-V曲线比较见图3。

图3 4组大鼠心室肌细胞灌流后INa的I-V曲线比较

由图3可见，4组大鼠心室肌细胞灌流后INa峰值电位均出现在-30 mV时。4组大鼠心室肌细胞INa的激活电位均出现在-60 mV时，反转电位出现在+20 mV时，4组激活电位和反转电位基本相同。

3 讨论

自1979年首例报道布比卡因毒性以来，对布比卡因毒性的研究一直在进行，而且不断深入[13]。布比卡因心脏毒性机理可能是其阻断了心肌细胞钠通道、钙通道和钾通道以及干扰线粒体的能量代谢等[10，14-16]。

既往动物和临床研究表明，右美托咪定可作为局部麻醉药辅佐剂增强局部麻醉药镇痛效果和延长镇痛时间。Brummett等[17]研究表明右美托咪定可增强布比卡因对坐骨神经感觉和运动的阻滞，而且未观察到神经毒性反应。在行腋路臂丛神经阻滞时，右美托咪定可缩短左旋布比卡因的起效时间，并延长其作用时间[18]。既往发现在采用罗哌卡因行肌间沟神经阻滞时，右美托咪定也有类似作用[19]。右美托咪定作为镇静剂在区域阻滞中也得到了广泛应用。有研究表明右美托咪定静脉使用可延长局部麻醉药的感觉和运动阻滞时间，使首次出现疼痛的时间延后[20]。右美托咪定静脉的应用还可以改善利多卡因镇痛质量，减少其他镇痛药物的使用[21-22]。

正因为右美托咪定和局部麻醉药同时使用的概率增加，右美托咪定对局部麻醉药心脏毒性的影响更值得关注。早在1993年就有学者发现α2受体激动剂可乐定可以减轻布比卡因心脏毒性，但是并不能解释具体机制[23]。Hanci等[9]也发现经过右美托咪定预处理后，SD大鼠对布比卡因有更好的耐受力，不过缺乏具体机制探讨。本研究采用全细胞膜片钳技术，研究了右美托咪定对布比卡因所致的大鼠心室肌INa的影响。研究中采用的右美托咪定浓度50 ng/mL接近临床浓度，而布比卡因50 μmol/L来源于前期研究结果[12]。该研究比较了40 μmol/L和50 μmol/L布比卡因对INa峰值的抑制作用，发现浓度50 μmol/L布比卡因抑制INa峰值效果更明显。本研究发现右美托咪定单独存在时也可以轻度抑制大鼠心室肌细胞INa峰值。既往研究同样发现右美托咪定对神经细胞的INa有抑制作用[24]，这与本研究结果一致。本研究还发现，右美托咪定和布比卡因混合后，可降低布比卡因对INa峰值的影响。猜测这一作用的原因是右美托咪定可以和布比卡因竞争性结合钠通道，类似经典的纳洛酮拮抗阿片类药物中毒。由于钠通道是布比卡因心脏毒性的主要靶点，因此右美托咪定减轻布比卡因对INa的抑制，有可能是其减轻布比卡因心脏毒性的机制之一，具体需要进一步研究确定。

综上所述，右美托咪定可部分恢复布比卡因所抑制的INa，这一作用是否参与了右美托咪定增强布比卡因心脏毒性耐受性过程，还需要进一步研究确定。