猪圆环病毒Ⅱ型与猪繁殖呼吸障碍综合征混合感染的诊断

王浩先，白金洋，张 颖，倪宏波

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319； 2.青岛农业大学)

猪圆环病毒属圆环病毒科，圆环病毒属，是一种直径17 nm的小型，无囊膜的单股负链环状DNA病毒，分为两种不同的基因型(PCV-Ⅰ和PCV-Ⅱ)[1]。PCV-Ⅱ感染所致的临床症状主要有5种[2]，即猪断奶后多系统衰弱综合征(PMWS)、猪肾病与皮炎综合征(DNS)、猪呼吸疾病综合征(PRDC)、猪繁殖障碍(PRF)和传染性先天性震颤(CT)。PCV-Ⅱ是断奶多系统消耗综合征(PMWS)的主要病因，其特征是进行性消瘦，呼吸障碍，肾病综合征和先天性震颤[3]。此外，由于PCV-Ⅱ是免疫抑制病毒，因此患病猪更容易受到其他病毒和细菌的侵害。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)又称蓝耳病，由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的烈性传染病。引起该病的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)[4,5]。猪群感染PRRSV的临床症状因不同生长阶段或轻重程度表现各异。主要的临床表现有流产、病毒血症与发热、分娩障碍、拒食、母猪死亡、仔猪带毒、断奶前死亡率增加、弱仔。严重程度与猪群的应激状况、并发感染、管理水平及病毒型等相关[5]。

1 材料与方法

1.1病料来源 安达市某规模化养猪场80余头40日龄断奶仔猪，生长迟缓，严重消瘦，精神沉郁，食欲下降或废绝，全身被毛粗乱，皮肤苍白，呼吸急促，偶有咳嗽和喘气，曾发生呕吐和腹泻。有猪瘟和伪狂犬的疫苗免疫史。

1.2送检样本 安达市某规模化猪场送检的一头40日龄患病猪，无菌采集患病猪肝、肺、脾、肾及小肠。

1.3检测试剂 MgCl2、10×Buffer、DL 2000 DNA Marker、dNTP、Taq DNA聚合酶(均购自大连宝生物工程有限公司)、TIAN amp Genomic DNA Kit DNA提取试剂盒(购自TIANGEN公司)、RNA simple Total RNA Kit RNA提取试剂盒(购自TIANGEN公司)、Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific-CN公司、生理盐水、去离子水、DEPC水、消化液、蛋白酶K、酚、酚-氯仿-异戊醇、氯仿-异戊醇、无水乙醇等。

1.4引物设计 参考GenBank中公开发表的猪瘟病毒(HC)、猪普通致病性猪蓝耳病(PRRS)、猪圆环病毒 Ⅱ型(PCV Ⅱ)、猪伪狂犬病毒(PR)的基因序列及相关文献设计特异性上下游引物。

1.5核酸提取及鉴定

1.5.1病料处理 无菌取各脏器小块病料，加DEPC水2 mL置于研磨管研磨，将研磨后的样品置于-20℃保存备用。

1.5.2组织DNA提取 使用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因DNA提取试剂盒，按说明书操作步骤提取组织总DNA，-20℃保存备用。

1.5.3组织RNA提取 使用RNAsimple Total RNA Kit 总RNA提取试剂盒，按说明书操作步骤提取组织总RNA，-20℃保存备用。

1.5.4RNA反转录 使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录盒，按说明书操作步骤将病毒提取的RNA反转录成cDNA，得到的cDNA在-20℃进行保存备用。

1.5.5PCR扩增及核酸电泳 用得到的DNA和cDNA为模板，圆环病毒及蓝耳病毒特异性引物进行PCR反应扩增。取5 μL的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果与分析

2.1剖检变化 病猪有腹膜炎和间质性肺炎症状、胸腔积液，肺脏出现间质性肺炎症状，胃肠鼓气、胃底部有多量出血点(图1)，肾脏外观灰红色，表面有结节、小出血点，切面有多量出血点，脾头严重肿大，边缘增宽，淡红黄色，有出血点(图2)，进一步切开后可见盲肠的回盲口部分有轻度的充血和肿胀，肠壁增厚，小肠肠粘膜有褶皱(图3)。

图1 胃底部出血点

图2 脾头肿大增宽

图3 肠粘膜褶皱

2.2PCR结果 PCR检测结果表明，在PCR扩增图的PCV中有880 bp左右的条带，与猪圆环病毒预期片段大小相符，在PCR扩增图的PRRSV中有300 bp左右的条带，与猪蓝耳病病毒预期片段大小相符(图4)。

图4 PCR扩增图

2.3细菌学检查 取病猪肺、肝、脾接种血琼脂培养基，37℃培养24 h，未见细菌生长。

2.4分析 根据PCR结果，判定为猪圆环病毒Ⅱ型和猪蓝耳病病毒混合感染。但剖检时蓝耳病症状相对较轻，根据该猪场既往病史，认定为隐形带毒状态的僵猪。剖检时发现肠壁增厚，小肠肠粘膜有褶皱，怀疑亦有猪慢性增生性肠炎混合感染，但细菌学检查后未发现致病菌感染。

3 讨论

3.1猪圆环病毒Ⅱ型感染一般会出现淋巴结病变，有不同程度的出血。肾脏出现病变，肾脏肿大、出血、有灰白色斑。脾脏病变，现为肿大、边缘出血，有少部分不发生肿大、质地变脆。胸腹水和弥漫性肺炎也是观察到的重要病理变化，病例可见肝脏花斑状条纹，肠或结肠黏膜充血、淤斑[6]。

3.2猪蓝耳病毒感染主要为各年龄的猪淋巴结肿大灰白色与肌肉灰白水肿，出血性肺炎和间质性肺炎。组织学变化，支气管上皮细胞纤毛的套管样脱落，肺巨噬细胞的活化增生。

3.3目前一般认为，PRRSV与PCV-2单独感染均不会导致猪大批发病死亡，但是它们常常混合感染，或与其他病原混合感染会导致死亡率升高，危害较大。因PCV-2与PRRSV均会使动物机体免疫机能下降，如有继发感染会造成大批仔猪死亡，经济损失较大， 故应采取综合防制措施[7]。猪圆环病毒病与高致病性猪蓝耳病都是一种免疫抑制疾病，病原可破坏机体的免疫系统，导致机体抗病力降低。 PCV-Ⅱ经常与PRRSV、猪伪狂犬病毒、副嗜血杆菌等病原发生混合感染或继发感染，如果猪场发病后，疫情会更加严重，病死率也大大增加。当PCV-Ⅱ与PRRSV同时感染时，PRRSV可以促进PCV-Ⅱ在体内的增殖。目前对猪圆环病毒病的防制主要是使用灭活疫苗对猪群进行免疫预防，同时结合生物安全、饲养管理和药物预防等综合防控措施，已达到防治该病的目的。

3.4加强饲养管理方面需要饲养场所保持环境的清洁，保证圈舍的通风性能良好，降低氨气等有毒有害气体的影响，养猪场的饲养密度要适当，不能追求经济效益而过度养殖，以免增加PRRSV和PCV-Ⅱ等疾病的发病概率。对阳性猪圈要进行严格、彻底的杀菌消毒，抑制传染源，以避免病毒感染扩大出现较大疫情[8]。