四种多糖体外抗氧化性及复合研究

张翔

【摘 要】为探讨灰树花、白桦茸、香菇、云芝真菌多糖的抗氧化性及复合抗氧化效果，采用水杨酸法及用L16（45） 正交实验，以羟自由基清除率为评判依据，对多糖进行充分优化组合，测定并比较单味多糖和复合多糖对羟自由基的清除率。结果显示：四种多糖对羟自由基的清除作用大小为：白桦茸>香菇>灰树花>云芝;四种真菌粗多糖清除羟自由基组方的L16（45）正交实验显示，其复合多糖的最佳组方为：4. 46mg/mL灰树花多糖、 4.22mg/mL白桦茸多糖、4.05mg/mL云芝多糖、 2.49mg/mL香菇糖组合。可见在相同浓度下复合多糖对羟自由基的清除率高于单味多糖清除率之和。灰树花、白桦茸、香菇、云芝粗多糖及复合多糖在体外对羟自由基有较强的抑制作用，且相同浓度下复合多糖的抑制率大于单味多糖。此研究为灰树花、白桦茸、香菇、云芝真菌粗多糖的应用及羟自由基清除剂的研究提供参考依据。

【关键词】真菌多糖;抗氧化性;水杨酸法

【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A【文章编号】1002-8714（2020）09-0002-01

自由基是一类具有高度活性的物质，能引起细胞和细胞器膜的脂类过氧化损伤，进一步导致细胞膜功能丧失，是产生疾病的主要原因之一[1]。因此，广泛地开发和寻找外源性的自由基清除剂具有重要意义。分子生物学的发展使人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能。多糖是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的生物大分子，在控制细胞的分裂分化、调节细胞的生长、延缓衰老和维持代谢等方面发挥着重要的作用[2]。

近年来的研究显示，一种真菌多糖通常对某一种生理效应有明显作用或效果单一，对食药用真菌多糖的研究逐渐向多种多糖复合生理效应的研究方向发展[3]。过往实验证明，一些食药用真菌多糖复合作用时，效果比单味多糖更佳，且它们之间的药理作用呈现协同性[4]。为此本研究在前人工作的基础上，拟以20%～40%含量的灰樹花、云芝、香菇、白桦茸真菌多糖为原料，进行抗氧化性及复合研究。

1 材料与方法

1.1仪器

UV1601紫外可见分光光度计、101-2BS 电热鼓风干燥箱、AL104型电子分析天平、KQ-5200DE超声波清洗器、CU420型电热恒温水箱、JB-90型清理电动搅拌机。

1.2试剂

乙醇、水杨酸、盐酸、硫酸亚铁、30%双氧水、香菇粗多糖、云芝粗多糖、白桦茸粗多糖、灰树花粗多糖及其他常规试剂。其中，多糖的含量分别为香菇33.20%、云芝40.45%、白桦茸42.16%、灰树花30.36%。

1.3方法和步骤

1.3.1紫外分光光度法测定真菌多糖羟自由基清除率

1.3.1.1实验原理

建立Fenton反应体系模型，利用H2O2与Fe2+混合产生·OH（H2O2+Fe2+→OH·+OH-+Fe3+），但由于·OH具有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉·OH，并产生有色产物。

该物质在510nm下有最大吸收，若在此反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色产物生成量减少。采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系（0.2mmol/LH2O21mL，6mmol/LFe2+1mL，6mmol/L1mL水杨酸-乙醇溶液）中加入一系列1mL不同浓度的待测样品。最后加H2O2启动反应，37℃反应30min，以超纯水：乙醇=3：1的混合溶液为参比，在510nm处测量各浓度下的吸光度。考虑待测溶液本底的吸光值不同，以6mmol/LFe2+1mL，6mmol/L水杨酸-乙醇溶液1mL，待测溶液1mL和双蒸水1mL作为待测溶液的本底吸收值。其清除率计算公式为：

清除率（I%）=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100%

式中：A0：空白对照液的吸光度;

Ax：加人待测溶液后的吸光度;

Ax0：待测溶液的本底吸收。

1.3.1.2实验步骤

1.3.1.2.1溶液的配制

①10mg/mL真菌粗多糖溶液：于分析天平上准确称量粗多糖成品1.0000g，溶解并定容至100mL容量瓶，摇匀并于超声波清洗机中超声30min;

②7.5、5.0、2.5、1.0mg/mL真菌粗多糖溶液：用吸量管吸取配制好的10mg/mL的粗多糖溶液，用蒸馏水进行稀释，并定容至50mL容量瓶中，摇匀;

36mmol/LFeSO4溶液：于分析天平准确称取硫酸亚铁固体粉末0.4170g，溶解、转移并定容至250mL容量瓶中，摇匀后避光保存;

40.2mmol/LH2O2溶液：用吸量管吸取30%H2O2溶液0.2mL于250mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度并摇匀，避光保存;

56mmol/L水杨酸—乙醇溶液：于分析天平准确称取水杨酸0.2097g，用乙醇全部溶解、转移并定容至250mL容量瓶，摇匀。

1.3.1.2.2加样方法

1.3.2四种多糖复合后清除羟自由基测定的原理和方法

本文用水杨酸分光光度法测定灰树花、云芝、桑黄、白桦茸粗多糖对羟自由基的清除率，并以此为依据，对其进行复合研究.

1.3.3.1测定原理和方法同1.3.1.

1.3.3.2灰树花、香菇、白桦茸、云芝复合多糖研究的正交实验设计

采用L16（45）正交实验测定灰树花、香菇、白桦茸、云芝多糖对羟自由基的清除率，进行多糖组合用剂量的复合的组方实验，四种粗多糖的正交实验的因素水平设计如表2。

2 结果及结论

2.1灰树花、香菇、白桦茸、云芝多糖对羟自由基清除率

按1.3.1方法测定灰树花、香菇、白桦茸、云芝多糖和VC羟自由基的清除率如表3所示，可见该四种多糖具有较强的清除羟自由基的活性，是良好的羟自由基清除剂和抗氧化剂。究其抗氧化作用的机制，可能是通过提升SOD、CAT、T-AOC水平和降低MDA含量等有关[5]。

2.1.1灰树花、香菇、白桦茸、云芝多糖的清除羟自由基作用的比较

按1.3.1方法测定灰树花、香菇、白桦茸、云芝多糖对羟自由基的清除率，显示四种多糖的清除羟自由基能力大小为：白桦茸>香菇>灰树花>云芝，白桦茸、香菇、灰树花、云芝多糖的最大清除率分别为：82.3%、74.5%、55.9%、52.7%。同样条件下测定VC的最大清除率为99.8%。

2.1.2灰树花、香菇、白桦茸、云芝多糖的清除羟自由基作用与VC比较

按1.3.1方法测定灰树花、香菇、白桦茸、云芝多糖和VC对羟自由基的清除率，当清除率同为50%时，需要的浓度分别为VC0.359mg/mL，香菇5.074mg/mL，云芝9.500mg/mL，灰树花8.829mg/mL，白桦茸3.965mg/mL。换算成质量，1gVC清除羟自由基的功效需要香菇14.1g或云芝26.5g或灰树花24.6g或白桦茸11.0g。

2.2多糖复合研究

2.2.1四种多糖复合组方正交实验结果

将四种复合多糖组方研究的因素水平设计进行L16（45）正交實验方案，用1.3.1方法测定复合多糖对羟自由基的清除率，其正交实验结果如表4所示.

2.2.2四种多糖复合组方正交实验结果的极差分析

对四种多糖复合多糖的正交实验结果进行极差分析，其结果如表5所示。

可得出如下结论：不同因素水平的影响强弱顺序为：A4>A2>A1>A3，B4>B1>B3>B2，C1>C4>C2>C3，D4>D1>D2>D4;影响因素大小顺序为B>C>A>D（R），从而初步认为最优配方组合为A4B4C1D4，即这四种复合多糖按其多糖含量计算其最佳组方为：4.46mg/mL灰树花多糖、4.22mg/mL白桦茸多糖、4.05mg/mL云芝多糖、2.49mg/mL香菇多糖组合;折合30.36%灰树花、42.16%白桦茸、40.45%云芝、33.20%香菇粗多糖的组方为：10mg/mL灰树花、10mg/mL白桦茸、1mg/mL香菇、7.5mg/mL云芝粗多糖组合。

2.2.3复合多糖与四种单味多糖对羟自由基的清除率比较

在复合多糖的正交实验中，当四种多糖的实测浓度为：1mg/mL、2.5mg/mL、5.0mg/mL、7.5mg/mL、10mg/mL时，其对羟自由基的抑制率分别为：19.1%、28.6%、47.9%、65.9%、72.8%，与同浓度的四种单一多糖对羟自由基的平均清除率的比较：在1mg/mL时，四种多糖清除率之和为13.5%，复合多糖则为19.1%;2.5mg/mL时，四种多糖清除率之和为23.3%，复合多糖则为28.6%;5.0mg/mL时，四种多糖清除率之和为41.2%，复合多糖为47.9%;7.5mg/mL时，四种多糖清除率之和为57.5%，复合多糖为65.9%;10mg/mL时，四种多糖清除率之和为66.4%，复合多糖为72.8%。由此可见，等量复合多糖比四种多糖对羟自由基清除率之和高，复合后的生物活性不是一种简单的相加关系，这种作用可能是多糖经复合后产生的协同和互补作用所致。由此认为，选择具有协同和互补作用的多糖进行优势组合，可有效的发挥和提高各种多糖的生物学活性，并且可在一定范围内减少用量，降低成本，提高功效。

参考文献

[1] 以蒙医学理论试论氧自由基与线粒体[J].伊拉古等.中国民族医药杂志.20120（26）.

[2] 黄芪多糖预防奶牛乳房炎的研究进展[J].沃野千里等.动物营养学报.2020（32）.

[3] 复合多糖抑制紫外线诱导皮肤细胞的光老化[J].杨凯业等.中国组织工程研究.2019（23）.

[4] 五种真菌的复合多糖体外抗氧化作用研究[J].于冲等.黑龙江科学.2018（9）.

[5] 中药多糖抗氧化作用及其机制研究进展[J].孟祥云等.中华中医药杂志.2018（33）.