HPLC法测定蒙成药额力根中栀子苷含量

崔丽敏，赵丽娜，王玉华

(内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010110)

额力根是由西红花、石榴、寒制红石膏、天竺黄、漏芦花、肉豆蔻、栀子等二十五味蒙药材组成的复方制剂。具有清“血”热、清“协日”热等功效，用于血热引起的各种肝热、乙型肝炎、肝腹疼痛等症。栀子是方中主要药味之一。栀子[1-4]中含有环烯醚萜类、二萜类、三萜类、黄酮类、有机酸酯类、挥发油类和多糖类等化合物[5-7]。栀子苷是栀子的主要指标性成分之一[8-9]。本文以高效液相色谱法测定额力根中栀子苷的含量并对制剂中栀子苷的含量限度进行了研究。

1 仪器与材料

岛津CTO-10AS型高效液相色谱仪(日本岛津)；Heal Force NW15UV型超纯水系统；Mettler-Toledo MS105DU型百万分之一电子天平和Mettler-Toledo XPR10型万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

额力根样品(批号1806111、1806112、806113)由巴彦淖尔市蒙医医院提供，自制样品(批号20190909)。

栀子苷对照品(批号110749-201617),购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，甲醇等试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Alltima C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈-水(15∶85)，流速：1.0mL/min；柱温箱：33℃；注入体积：10μL；测定波长：238nm。

2.2 配制对照品溶液

取栀子苷对照品，加入甲醇配制成每1mL含30μg的溶液，作为对照品溶液。

2.3 配制供试品溶液

取额力根粉末约0.7g，精密称定，置锥形瓶中，准确加入甲醇25mL，称定样品，溶剂及瓶的重量，超声提取30分钟后，放冷，用甲醇补足提取过程中的溶剂的重量，摇匀，过滤，取续滤液，再用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.4 配制阴性对照溶液

取按处方比例，配制的不含栀子药材的阴性供试品，配制阴性对照溶液，即得。

2.5 专属性试验

精密吸取阴性对照，供试品和对照品溶液各10μL，注入色谱仪中，记录色谱图。见图1。

在同一保留时间8.807min处，供试品在栀子苷色谱图相同保留时间处有相同栀子苷吸收峰；而阴性对照在栀子苷相同保留时间处无吸收峰。实验结果表明此方法专属性良好。

2.6 线性关系的考察

栀子苷对照品加入甲醇使溶解并制成浓度为30μg/mL的对照品溶液，吸取1、3、5、7、10、12、15、20μL，注入色谱仪，记录色谱图，以峰面积(Y)为纵坐标，栀子苷注入量(X)为横坐标，进行回归分析。结果栀子苷在0.03-0.60μg范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.9996)，回归方程为Y=0.5045X+0.0699。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8h注入液相色谱仪，记录峰面积，考察溶液的稳定性。结果在不同时间点测得栀子苷峰面积的RSD为1.99%，供试品溶液在8h内基本稳定。

2.8 精密度试验

取同一供试品溶液，连续注入6次，记录栀子苷峰面积积分值。结果栀子苷峰面积的RSD为0.37%，液相色谱仪精密度良好。

2.9 重复性试验

取同一供试品6份，配制成供试品溶液，注入10μl，记录色谱图，计算含量。6份样品栀子苷的平均含量为1.48mg/g，RSD为0.36%。方法重复性良好。

2.10 加样回收试验

取已知含量供试品9份，每份约0.35g，精密称定，分别每份加入一定量的栀子苷对照品溶液，配制成供试品溶液，注入10μl，记录色谱图，计算回收率。见表1。

表1 加样回收试验结果(n=9)

表1中的数据显示，平均加样回收率为93.98%(n=9)，RSD为1.86%，本方法准确度较好。

2.11 样品测定

取样品以及自制样品各约0.7g，精密称定配制成供试品溶液，注入10μl，记录色谱图，以外标法计算栀子苷含量。见表2。

表2 样品中栀子苷含量测定结果

表2的数据显示，医院提供的三批样品含量约为1.4mg/g，研究者自制样品的含量为2.7mg/g。这说明栀子药材的质量，对成品中栀子苷的含量影响较大。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取栀子苷对照品溶液在200～600nm波长处进行光谱扫描，结果栀子苷在波长238nm处有最大吸收，与《中国药典》2015年版一部“栀子”项下有关规定[10]一致，故选择238nm作为检测波长。

3.2 流动相的筛选

本试验考察了一定比例的甲醇-水、乙腈-水作为流动相的测定，经比较认为甲醇-水作为流动相时存在分离效果不好、峰形差的问题。以乙腈-水(15∶85)作为流动相时，供试品中栀子苷与其他组分能达到较好的分离，色谱峰具有较好分离度和对称性，重现性好且基线稳定,故最终选择流动相为乙腈-水(15∶85)。

3.3 提取时间的选择

在供试品粉碎粒度一致，提取溶剂为甲醇的条件下，考察了超声提取20分钟、30分钟和40分钟对提取效率的影响，结果超声处理30min后，采用本方法测定栀子苷的含量基本不再增加，故确定超声提取时间为30min。

3.4 含量限度的制定

本次实验采用HPLC法对供试品及栀子药材进行测定，结果栀子苷的平均转移率为80.88%，根据《中国药典》2015年版一部“栀子”项下有关规定[10]，栀子苷含量限度不得少于1.8%，考虑不同产地栀子药材和生产过程的粉碎时造成损失量不同，经计算含量下浮20%，确定本品每1g含栀子苷不得少于0.43mg。

高效液相色谱法作为额力根中栀子苷含量的检测方法，实验结果重复性良好，供试品溶液在实验过程中稳定性好，此方法为今后额力根的质量标准的制定提供了数据参考。