HPLC法测定蒙药嘎日迪-15丸中没食子酸的含量

冯智翱，薄彧坤，杨 丹，安 明*

(1.包头医学院药学院2019级研究生，内蒙古 包头 014060；2.包头医学院，内蒙古 包头 014060)

嘎日迪-15丸是由草乌(制)、麝香、诃子、木香、石菖蒲、栀子、川楝子、决明子、茼麻子、枫香脂、五灵脂、文冠木、瞿麦、黑云香、沉香共15味药组成。具有燥“协日乌素”、消“黏”、治疗游痛症，疮疡、消肿作用的功效，尤其对风湿、骨关节疾病有突出的疗效[1]。诃子为嘎日迪-15丸中的主药具有抗氧化、镇痛、保肝等功效，没食子酸为其主要活性物质。本实验参考诃子相关含量测定文献以及2015年版《中国药典》中没食子酸的含量测定方法。建立了测定没食子酸的高效液相色谱法。该方法操作简单，专属性强。目前嘎日迪-15质量控制方面无含量测定项。本实验将采用HPLC法对其中的没食子酸含量进行测定。为该药材的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器UItimate

3000系列高效液相色谱仪、SartoriusBSA224S-CW电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 试剂

甲醇色谱纯，磷酸分析纯，实验用水为超纯水。

1.3 试药

没食子酸(110931-201705)，诃子对照药材(122015-201705)均由中国食品药品检定研究院提供；嘎日迪-15(807311、901111、807312由包头市蒙中医院制剂室提供)；模拟样(自制)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

SHIMADZU-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相为甲醇-0.05%磷酸水溶液(10∶90)；柱温：30℃；检测波长：272nm[2]；流速：1.0ml·min-1；进样量：10μl。理论板数4000以上。

2.2 对照品溶液的制备

准确称取没食子酸对照品10.21mg，置100ml容量瓶中加50%甲醇溶解(用于加样回收率实验)。取1ml于10ml容量瓶中加50%甲醇溶解至刻度，制成浓度为10.21μg/ml的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品精密称定约0.2g，置具塞锥形瓶中。精密加入50%的甲醇50ml称重。超声处理40min、冷却、50%的甲醇补重。过滤取续滤液，用0.22um微孔滤膜滤过，即得。

2.4 阴性溶液的制备

按照处方比例取嘎日迪-15丸中除诃子以外的其他药材，准确称定，研细，照“2.3”项下方法制成阴性溶液。

2.5 诃子药材溶液的制备

称取诃子药材约0.014g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇50ml称重。超声处理40min、冷却，50%的甲醇补重，过滤取续滤液,经0.22um微孔滤膜滤过，即得。

2.6 模拟样溶液的配制

按照处方比例称取嘎日迪-15所需药材，混合，研细。准确称定约0.2g,置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇50ml称定重量，超声处理40min放冷，再次称重并用50%的甲醇补重，在5000r/min的离心机中离心10min，取续滤液,经0.22um微孔滤膜滤过，即得[3]。

2.7 专属性试验

对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各10μl，注入液相色谱仪，按“2.1”项下的色谱条件测定。结果证明，供试品溶液中没食子酸的分离度良好。对照品溶液和供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，阴性对照溶液无干扰。由此证明此方法专属性良好[4]。结果见附录，图1～图3。

2.8 提取效率试验

2.8.1超声时间的选择

提取溶剂为50%甲醇50ml.分别超声提取30min，40min，50min。考察不同超声提取时间对提取效率的影响，结果见表1[5]。

表1 超声时间的选择试验

表1表明，提取时间为40min没食子酸的含量最高，故选择超声时间为40min。

2.8.2提取溶剂的选择

以25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇50ml作为提取溶剂，超声提取40min。试验中考察了溶剂甲醇与水的比例不同对提取效率的影响，结果见表2。

表2 提取溶剂的选择试验

表2表明，甲醇水比例为50%时提取效率最高，故选择50%的甲醇水作为溶剂进行提取试验。

2.8.3提取溶剂量加入量的考察

以50%甲醇25ml、50ml、100ml作为提取溶剂，超声提取40min，考察溶剂的量不同对提取效率的影响，结果见表3。

表3 提取完全试验考察

表3表明，50%甲醇50ml,超声提取40min时的提取效率最高，故选择50%甲醇50ml超声提取40min来进行溶液的配制。

2.9 线性关系考察

取10mg(实际取了0.01021g)没食子酸对照品入20ml容量瓶加50%甲醇至刻度线摇匀。后取1ml入25ml容量瓶加溶剂至刻度线，制成20.42μg/ml的对照品溶液。分别用移液管精密吸取2ml、4ml、6ml、8ml入10ml容量瓶，分别稀释成4.08μg/ml、8.17μg/ml、12.25μg/ml、16.34μg/ml、20.42μg/ml的对照品溶液。各吸取10ul注入高效液相色谱仪中。以峰面积对浓度进行回归分析，结果显示没食子酸4.08μg/ml～20.42μg/ml范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=0.522679x+0.0249(r=0.9999，n=5)。结果见表4。

表4 没食子酸的标准曲线

结果显示：没食子酸在4.08μg/ml～20.42μg/ml的浓度范围内同相应峰面积呈良好的线性关系。标准曲线见附录，图4。

2.10 精密度试验

取2.2项下的没食子酸对照品溶液,按照2.1项下的色谱条件连续进样5针，进样量10μl，其峰面积的平均值为5.4878，RSD为0.13%。说明仪器精密度良好。

2.11 稳定性试验

取同一供试品溶液，在0h,2h,4h,8h,12h,24h的时间点按照2.1项下条件进行测定，结果见表5。没食子酸的峰面积积分值的RSD值为0.71%，表明供试品溶液在24小时内稳定。

表5 不同时间测定样品中没食子酸的峰面积积分值

2.12 重复性试验

取同一批号样品(批号807311)6份，每份各取约0.2g，按照“2.3”项下的方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行含量测定，没食子酸含量的RSD值为0.89%结果见表6。色谱图见附录，图5。

表6 重复性试验含量测定结果

由表中数据可知，嘎日迪-15的重复性良好。

2.13 加样回收率试验

精密称定供试品(批号807311)9份，每份约0.1g，分别置于9个具塞锥形瓶中并分成三组。每组分别用移液管加入没食子酸对照品溶液(102.1μg/ml)1ml，2ml,3ml。(约相当于供试品含量的50%，100%，150%)，再加入50%甲醇49ml，48ml，47ml，照2.3项下的方法处理后各10μl注入高效液相色谱仪中。得没食子酸的平均回收率为100.65%，RSD值1.12%结果见表7。

表7 加样回收率测定结果

结果表明：本方法具有较好的回收率。

3 样品含量测定

取样品三批(批号为：807311、901111、807312)每批两份，模拟样品两批每批两份，按2.3项下的方法处理并测定，测定结果见表8。

表8 样品测定结果

用相同方法对模拟样品中的诃子药材进行测定，测的结果见表9。

表9 诃子药材中没食子酸的含量测定

按理论值折算，模拟样品应含没食子酸 1.92mg/g,没食子酸转移率=1.92/1.925×100%=100.1%。由于2015版《中国药典》一部中没有诃子的含量指标，在确定本品含量时，测定了2批诃子药材，平均含没食子酸为24.50mg/g。本品含量限度为=14.2/199.51×24.503×100.16%=1.745mg/g。考虑到药材质量差异，下浮10%，故暂定本品每1.0g含诃子以没食子酸(C5H6O5)计不得少于1.57mg。

4 讨论

4.1 检测波长的选择

参考《中国药典》中没食子酸的检测波长为271nm。取2.2项下溶液，自200nm-600nm通过二极管阵列检测器做光谱扫描。没食子酸在波长272nm与216nm处有最大吸收且分离度良好，所以选用272nm做为检测波长[6]。

4.2 流动相的选择

参照《中国药典》2015年版四部“没食子酸”项下的流动相条件0.05%磷酸溶液-甲醇(93∶7)进行摸索。此条件下没食子酸峰形良好且无干扰，但保留时间较晚。因此，流动相确定为0.05%磷酸溶液-甲醇(90∶10)[7]。

4.3 提取溶剂的选择

参照内蒙古蒙药制剂规范,“苏日也”丸项下没食子酸的含量测定方法，选用甲醇作为提取溶剂。根据2.8项下的试验得出，以50%甲醇50ml为溶剂超声40min的提取效率最佳。

5 结论

采用高效液相色谱法测定嘎日迪-15中没食子酸的含量，结果分离度良好。本含量测定方法简便快捷，专属性强，重现性好。可作为嘎日迪-15的质量控制的标准。