超高效液相色谱-串联质谱法同时测定外用制剂中非法添加13种抗真菌化学成分

张艳萍，周宗洲，黄婉锋，张 敏，何作民，钱 鑫，关倩怡

(1.广东省佛山市食品药品检验检测中心，广东佛山 528051；2.广东省佛山市疾病预防控制中心，广东佛山 528051)

在人类生活的环境中，存在很多不同类型的真菌，一旦出现感染，对于身体的健康会产生消极的影响，真菌无孔不入，会威胁到人们的身体健康和生活工作，真菌感染容易引发脚气，体癣，头癣，甲癣、小儿鹅口疮，以及女性真菌性阴道炎等各种疾病，对于这类疾病，一般通过涂擦抗真菌化学药如酮康唑、制霉菌素就能达到治愈的目的，但随着生活素质的提高，大众普遍认为，抗真菌化学药副作用大，纯中药成分制剂副作用相对较少，因而越来越受到大家的青睐，而这种心理会被某些不法生产厂家所利用，这些厂家通过突显产品“绿色、健康、纯天然”，以及迎合患者急于见效的心理，在生产的纯中药抗真菌外用制剂品种中非法添加含量未知的抗真菌类化学成分，从而达到增强疗效的作用，虽然在治疗疾病上一样具有疗效，但由于其添加的抗真菌类化学成分种类和含量未知，如果使用者在不知情下长期大量使用这类产品，会对人体的生理代谢产生毒副作用，同时易引起肝肾损伤，对人体造成损害。因此加强对外用制剂中非法添加抗真菌类化学成分类型及鉴别方法的分析研究，建立外用制剂中抗真菌类化学成分检测方法极为重要，可以进一步提高监督管理部门对流通环节中假劣外用制剂的查处率，使制假违法行为得到有效遏制。

目前，关于抗真菌类化学成分检测方法主要有高效液相色谱法[1-4]，液质联用法[5-8]，有报道的液质联用法同时测定抗真菌类化学成分最多为9种[9]，尚未有本实验抗真菌化学成分舍他康唑和氟胞嘧啶的液质联用法报道，同时也尚未发现用高效液相色谱-串联质谱同时测定本研究的13种抗真菌化学成分。《中国药典》2015年版收载的抗真菌类药物的检测方法也是单一成分的检测方法，将单一成分检测方法应用于监管部门突发打假抽检的药品抗真菌类的检测将耗费大量的检测时间，并且无法达到监管部门要求的快速出具检验报告的要求。

采用溶剂提取外用制剂中可能非法添加的咪康唑等13种抗真菌类化学成分，优化色谱参数和质谱参数，建立同时测定外用制剂中非法添加的咪康唑等13种抗真菌类药物的UPLC-MS/MS 检测方法。并将该方法应用于抽检的外用制剂检验，可快速为监督监管部门提供检测数据，其检验报告可作为中药制剂中非法添加咪康唑等抗真菌类药物的有效判定依据。同时也将更好的应对本地区药品监督非法添加应急检验工作，为打击售假、掺假提供科学技术依据，为药品安全监督检验工作提供技术保障和支持。

本文采用正离子检测模式，多反应检测，建立同时测定咪康唑等13种抗真菌化学成分的UPLC-MS/MS检测方法，进行了方法学验证，并应用于外用制剂样品检测。该法简便快速、方法灵敏度高，可用于外用制剂的质量控制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

美国Waters xevo TQ三重四级杆液质联用仪，瑞士梅特勒-托利多XPR10电子分析天平，美国赛多利斯BS 224S电子天平，对照品氟胞嘧啶(批号 100315-201502，含量100%)、氟康唑(批号 100314-201204，含量99.8%)、醋酸氯己定(批号100183-201003，含量96.9%)、酮康唑(批号 100294-200602，含量99.9%)、盐酸萘替芬(批号100823-200501，含量100%)、克霉唑(批号100037-200306，含量100%)、伏立康唑(批号100862-201402，含量99.2%)、盐酸特比萘芬(批号100563-201402，含量99.9%)、伊曲康唑(批号100631-201402，含量99.2%)、硝酸益康唑(批号100214-201204，含量99.6%)、灰黄霉素(批号130426-9101，含量99.0%)均购自中国食品药品检定研究院，咪康唑(批号2-AGE-8-1，含量98%)、购自TRC硝酸舍他康唑(批号S0460000，含量100%)、购自EP。甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸为色谱纯，水为超纯水。供试品为监管部门提供的监督抽检样品和自行购买的网络热销样品。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

2.1.1对照品储备液

精密称取各对照品约4mg于20ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为200μg·mL-1的对照储备液。

2.1.2混合对照品中间液

分别精密吸取氟胞嘧啶、醋酸氯己定、酮康唑各2.00ml；氟康唑、伊曲康唑、灰黄霉素各0.50ml；伏立康唑0.125ml；萘替芬、克霉唑、特比奈酚、咪康唑、舍他康唑0.05ml；益康唑0.025ml至同一20ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成氟胞嘧啶、醋酸氯己定、酮康唑质量浓度为20μg·mL-1；氟康唑、伊曲康唑、灰黄霉素质量浓度为5μg·mL-1；伏立康唑质量浓度为1.25μg·mL-1；萘替芬、克霉唑、特比奈酚、咪康唑、舍他康唑质量浓度为0.5μg·mL-1；益康唑质量浓度为0.25μg·mL-1的混合对照品中间液。

2.1.3混合标准使用溶液的配制

准确移取混合对照品中间液适量，配制氟胞嘧啶、醋酸氯己定、酮康唑贝浓度范围约为0.08～2.0μg·mL-1，氟康唑、伊曲康唑、灰黄霉素浓度范围约为0.02μg·mL-1～0.50μg·mL-1，伏立康唑浓度范围为0.05μg·mL-1～0.125μg·mL-1，萘替芬、克霉唑、、特比奈酚、咪康唑、舍他康唑浓度范围约为0.002μg·mL-1～0.05μg·mL-1，益康唑浓度范围约为0.001μg·mL-1～0.025μg·mL-1的混合标准使用溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取固体样品0.2g或精密量取溶液2.0ml于20mL容量瓶中，加入50%乙腈溶液，漩涡振荡器振荡1min,再超声提取20min,静置，用50%乙腈溶液定容至刻度，混匀后转移至离心管中，10000r.min-1离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，作为供试品溶液，如果供试品溶液的浓度超出标准曲线的线性范围，可用10%乙腈溶液适当稀释至标准曲线线性范围内，再进行分析。

2.3 色谱与质谱条件

2.3.1色谱条件

色谱柱 ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1×100mm，1.7μm)流动相为含0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脱：0.0～1.0min，90%A；1.0～2.3min，90%A～70%A；2.3～6.0min，70%A～60%A；6.0～7.0min，60%A～50%A；7.0～8.5min，50%A～30%A；8.5～9.5min，30%A～20%A；9.5～9.6min，20%A～90%A；9.6～11.0min，90%A；柱温：30℃,流速：0.30mL/min,进样量：1μL。

2.3.2质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，正离子检测，离子源温度:150℃，毛细管电压：3.5KV，脱溶剂温度：550℃，多反应监测(MRM)，其各组分质谱参数见表1，标准TIC图谱见图1。

表1 13种化学成分质谱参数

2.4 线性关系考察

取混合标准使用溶液各1uL进样分析，记录色谱图。结果见表2，表明质量浓度在规定的范围内线性关系良好，线性相关系数大于0.99。同时将适量混合标准中间液加入不含上述13种抗真菌成分的样品中，按“2.2”进行样品处理，以信噪比为3∶1时计算检测下限(LOD)，以信噪比为1∶1时计算定量下限(LOD)结果见表2。

表2 13种化学成分的线性范围及相关系数等

2.5 精密度试验

精密吸取混合标准使用溶液中一浓度1μl,连续进样6次，记录色谱峰峰面积，计算13种抗真菌类药物峰面积的相对标准偏差，其结果分别为4.2%、3.6%、3.4%、2.9%、3.0%、2.5%、2.6%、1.5%、2.2%、3.5%、1.2%、2.3%、1.8%；试验结果显示仪器精密度良好。

2.6 回收率实验

精密称取6份不含上述13种抗真菌化学成分的样品0.20g，添加低、中、高3种不同浓度的混合标准中间液，按“2.2”进行样品处理，经液质联用仪测定，计算回收率。结果表明：13种抗真菌化学成分加标回收率为87.4%～113.5%，RSD为1.1%～6.9%，均能满足方法学要求。结果见表3。

表3 13种抗真菌化学成分回收率及精密度试验结果(n=6)

2.7 方法应用

按照上述建立液质方法，对10批抽样样品和网购热销样品进行测定，结果发现，有6批样品检出抗真菌类化学成分，抽检样品3批，网购样品3批，其样品代表图谱见图2，样品具体检测结果见表4。

表4 样品含量测定结果(mg·g-1)

3 讨论

3.1 提取方法优化

抗真菌化学成分一般均能溶于乙腈、甲醇[10-11]，但由于样品剂型多样，基质成分复杂，试验发现，部分样品，特别是膏剂，在纯甲醇或纯乙腈溶剂未能均匀分撒，可能会造成非法添加的抗真菌化学成分无法完全提取。而用甲醇水溶液或乙腈水溶液则可以避免样品上述情况，同时也可以避免液质联用溶剂效应的影响，本文分别考察了不同体积比的甲醇水溶液和乙腈水溶液，发现采用50%乙腈溶液进行提取，基质干扰较小，方便快捷。同时也考察了不同的提取时间(超声10min、20min、30min)对提取效率的影响及整体考虑有些组分的稳定性，最终样品超声时间选择20min。

3.2 色谱条件的优化

本实验尝试了不能比例的甲酸水-甲醇系统、甲酸水-乙腈系统、甲酸胺-甲醇系统、乙酸铵-乙腈系统溶液等流动性组合进行梯度洗脱，结果发现0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液分离度最佳，各化学成分峰型较好。本实验分析了UPLC BEH C18、C8两款色谱柱的分离效果，发现C18柱无论从分离度，峰形等方面都优于C8柱，最终选择C18色谱柱，同时分析比较了在同一梯度条件下不同柱长UPLC BEH C18柱的分离效果，虽然短柱分析速度快，但组分咪康唑舍和他康唑完全重合，未能达到分离要求，因此选择柱长为100mm的C18色谱柱。

3.3 样品检测结果分析

应用本方法对10批外用制剂进行了分析测定，1批次检出酮康唑和咪康唑，含量分别为0.2mg·g-1、11.3mg·g-1，1批次检出咪康唑和特比萘芬含量分别为10.9mg·g-1、2.0mg·g-1,4批次检出咪康唑，含量分别为26.7mg·g-1、32.3mg·g-1、6.4mg·g-1、18.1mg·g-1。从结果可知，在外用制剂中抗真菌类成分检出率非常高，特别是咪康唑，10批样品中有6批样品中检出，咪康唑是高效、安全、属于咪唑类广谱抗真菌药，对致病性真菌几乎都有作用，广泛用于如头癣、手癣、脚癣、但其具有较强的毒副作用和耐药性，盲目使用对患者身心健康有较大影响。从检测结果可知，外用制剂膏剂中添加抗真菌类化学成分非常严重，部分膏剂属于消字号外用制剂，其本应只具有皮肤清洁，卫生和消毒作用，并不具有药物的治疗功效，而且没有经过严格的药品试验论证，其不良反应并不明确，这类产品被不良生产厂家宣传为“纯中药配方”，却暗地里大量添加化学成分，消费者长期使用后很可能导致严重后果，希望能引起有关监管部门的重视，保障市民用药科学、安全有效。

本研究所建立的方法可同时用于外用制剂中可能非法添加的13种抗真菌类化学成分的定性筛查和定量分析，在10min中内完成了对所有化合物的分析测定，在保证分离的情况下，实现了快速有效的高通量分析，检测的化合物较为全面，可为监测外用制剂中非法添加抗真菌药物提供强有力的技术支持。本分析方法灵敏，精密度高，回收率好，液相色谱-质谱联用、多反应监测方法能很好的排除复杂制剂中背景干扰，结果准确、真实，可作为分析添加违禁药物的有效手段，为打击外用制剂的制假行为，提供了有利的技术保障。