黄酒酵母在黄酒发酵过程中产芳香醇差异分析

周佳冰，张雅卿，刘双平，徐岳正，周建弟，毛 健，

（1.粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江南大学食品学院，江苏无锡 214122；2.江苏省产业技术研究院食品生物技术研究所（如皋江大食品生物技术研究所有限公司），江苏南通 226500；3.国家黄酒工程技术研究中心,浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司,浙江绍兴 312000）

黄酒作为中华民族历史最悠久、最古老的特色酒精饮料，是以稻米、黍米、小米、玉米、小麦、水等为主要原料，经加曲和部分酶制剂、酵母等糖化发酵剂酿制而成的发酵酒，与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒[1-3]。黄酒酒性柔和，酒味醇厚，蛋白质种类丰富，并且富含氨基酸等多种营养成分[4-5]。

高级醇是含3个以上碳原子的醇类的总称，是酒类发酵过程中产生的主要副产物，主要由酿酒酵母代谢所产生[14]，芳香醇则是带有苯环的高级醇，主要包括β-苯乙醇、酪醇与色醇，是黄酒中主要的风味物质，黄桂东等[11]对不同年份半干型绍兴酒分析发现，高级醇中β-苯乙醇对香气的贡献最大。酿酒酵母体内芳香醇的合成主要通过Ehrlich途径和莽草酸途径[16-19]，莽草酸途径合成芳香醇代谢途径长、存在多种抑制作用，这也使得酵母通过该途径合成芳香醇的量一般都偏低。较高含量的芳香醇会产生一定的致醉性，但适量的芳香醇可以赋予黄酒特有的醇香、丰满圆润和协调的口感[6-10]；而料酒作为以黄酒为主要原料的调味品，在烹调过程中具有增加食物香味的作用[12-13]，也需要控制适宜的芳香醇含量。

不同的酵母菌种的生理特性各不相同，在发酵过程中代谢副产物的种类及含量存在显著差异[15]，为了有效控制黄酒中芳香醇的含量，探究黄酒酵母与酿酒酵母模式菌产芳香醇差异及原因是非常有必要的。本文通过比较芳香醇高产菌株黄酒酵母HJ与酿酒酵母模式菌株BY4743在黄酒发酵过程中(前酵0～120 h，后酵120～480 h)的理化指标、芳香醇与氨基酸的动态变化，探究黄酒酵母产芳香醇差异及影响因素，为黄酒中芳香醇的调控提供重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：生麦曲、熟麦曲，古越龙山绍兴酒股份有限公司；粳糯米，市售。

菌种：黄酒酵母HJ，古越龙山绍兴酒股份有限公司；模式菌株BY4743，由实验室保存。

试剂及耗材：β-苯乙醇、色醇、酪醇、甲醇等均为色谱纯；氯仿、异戊醇、冰乙酸、三氯乙酸，国药集团化学试剂有限公司；糖化酶（120000 U/mL）、液化酶（120000 U/mL），苏州宏达制酶有限公司。

仪器设备：高效液相色谱Waters e2695，美国沃特世公司；Trace 1300 ISQ单四级杆气质联用仪，赛默飞世尔科技有限公司；超声清洗机，昆山市超声仪器有限公司；金属浴，杭州奥盛仪器有限公司；小型高速离心机，赛默飞世尔科技有限公司；水浴恒温振荡器，太仓市强乐实验设备有限公司；全自动立式蒸汽灭菌器，驰通仪器（上海）有限公司；pH计，瑞士Mettler Toledo公司；紫外可见光分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酒制作

（1）酵母的活化

配制一定量的YPD培养基，分装，115 ℃灭菌20 min；按8 ‰的接种量将甘油保藏管的酵母菌（黄酒酵母HJ与模式菌BY4743）分别转接到YPD培养基中，在无菌操作台进行转接；将转接好的酵母在30 ℃，200 r/min条件下，培养24 h，备用。

（2）酒母的培养

米饭、水按1∶4比例混合，加入液化酶（1.1‰）、糖化酶（1.1‰）和生麦曲（10%）进行液化与糖化，温度控制在60 ℃，时间3～4 h，糖化结束后外观糖度不低于12°Bx，115 ℃灭菌20 min，待冷却至24～31 ℃，分别接入（1）中培养成熟的酵母种子培养液5%，培养温度不超过31 ℃，培养时间20 h，培养成熟后备用。

（3）蒸饭

称取一定量的米，加入常温自来水，浸泡1 d。将蒸锅中的水烧开，取一定量的米均匀分散在纱布之上，蒸煮10 min，后用85 ℃以上的热水进行喷洒，将喷洒后的米饭再次蒸煮10 min，准备出锅。将蒸好的米饭摊冷，准备落料。

（4）落料

按照表1配方将米饭、自来水、生麦曲、熟麦曲、酒母同时加入，并混合均匀，两个发酵体系除酒母外均保持一致。前发酵：28 ℃恒温发酵5 d，前5 d每天开耙不少于1次，头耙时间8～10 h。后发酵：后酵时间15 d，后酵控制温度15 ℃±2 ℃。每2 d搅拌开耙1次。

表1 黄酒发酵体系

（5）发酵与取样

按照（4）中发酵体系及发酵温度进行发酵，黄酒酵母HJ与模式菌BY4743均取3个平行。分别在发酵24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、216 h、288 h、360 h、480 h时间点取样，共计10次。

1.2.2 理化指标的测定

总酸采用酸碱滴定法、氨基态氮采用甲醛滴定法进行测定，具体方法见GB/T 13662—2018《黄酒》；还原糖含量的测定采用DNS法[22]。

1.2.3 HPLC测定酪醇与色醇

（1）标准溶液的配制

以水为溶剂，配制酪醇600 mg/L、色醇600 mg/L的混合标准储备溶液。将混合标准储备溶液分别稀释100倍、50倍、10倍、2倍后进样，以峰面积为横坐标，标准物质浓度为纵坐标，进行线性回归。

（2）色谱条件

色谱柱：XBridge C18(250×4.6 mm，5 μm)；检测波长280 nm。采用峰面积外标法定量；柱温：30 ℃；流速：0.75 mL/min；进样量：10 μL；流动相：甲醇∶水∶冰乙酸（50∶49∶1）。

（3）样品的处理

取10 mL样品12000 r/min离心10 min，取3 mL上清液与3 mL的10 %三氯乙酸溶液混合，涡旋混匀1 min，于4 ℃下静置4 h，取上清液1 mL过0.22 μm有机滤膜后可直接进样测定。根据标准曲线回归方程计算样品中的芳香醇含量。

1.2.4 β-苯乙醇的测定

采用气质联用法（GC-MS）测定黄酒样品中的β-苯乙醇含量，样品预处理方法以及检测方法参照已有文献[23]。

1.2.5 发酵醪中20种游离氨基酸与水解氨基酸含量的测定方法

（1）游离氨基酸处理方法

利用异硫氰酸苯酯衍生剂与游离氨基酸进行衍生反应，采用HPLC测定发酵醪中游离氨基酸，具体方法参照文献[27]。

（2）酸水解氨基酸测定方法

称取150 mg左右均质后的黄酒发酵醪于水解管中，加8 mL HCl（6 mol/L）摇匀，充氮气3 min，拧紧水解管，放入120 ℃烘箱水解22 h，将水解管样品转移至容量瓶中，加4.8 mL NaOH（10 mol/L）中和，定容至25 mL，双层滤纸过滤，取1 mL澄清液离心(15000 r/min，30 min)，上清液过膜待测，测定方法同1.2.5.1。

（3）碱水解氨基酸(色氨酸)测定方法

称取150 mg均质后的黄酒发酵醪于水解管中，加8 mL NaOH（5 mol/L）摇匀，充氮气3 min，拧紧水解管，放入120 ℃烘箱水解22 h，将水解管样品转移至容量瓶中，加6.7 mL HCl（6 mol/L）中和，定容至25 mL，双层滤纸过滤，取1 mL澄清液离心(15000 r/min，30 min)，上清液过膜待测，测定方法同1.2.5(1)。

1.2.6 酸性蛋白酶活力测定

酸性蛋白酶活力的测定参考《工业酶制剂通用试验方法》，定义1 g黄酒发酵醪在30 ℃、pH 3.0的条件下，1 min水解酪蛋白为1 μg酪氨酸，为1个酶活力单位，单位是U/g。

1.3 数据处理

每个样品设3个平行，采用Excel 2013和origin 2018软件进行数据处理，测试结果以平均值±标准差来表示；采用R 3.5.1中的corrplot包绘制相关性分析图；SPSS 25.0对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 发酵过程理化指标变化曲线

不同的酵母有着不一样的发酵特性[15]，因此它们在相同条件下发酵产生的酒精度等理化指标也有着一定的差异。由图1可知，黄酒酵母HJ还原糖的消耗速率明显快于模式菌BY4743，黄酒酵母HJ在发酵第96 h还原糖已消耗殆尽，而模式菌BY4743直到120 h才被消耗完；黄酒酵母HJ具有较高的发酵效率，在发酵结束时其酒精度比模式菌BY4743高1 %vol左右；氨基态氮的含量均随着发酵时间的延长而升高，在发酵结束时达到最高。结果表明，黄酒酵母HJ在黄酒发酵过程中还原糖消耗能力与产酒精能力要强于模式菌株BY4743。

2.2 总氨基酸与游离氨基酸的变化

2.2.1 黄酒发酵过程总氨基酸变化

黄酒中的氨基酸是一类重要的营养素，主要来自原料及微生物的代谢作用[30]，且酵母能够利用氨基酸通过Ehrilch途径合成相应的醇[17]。由表2可知，黄酒在发酵初期有较为丰富的总氨基酸，黄酒酵母HJ与模式菌BY4743在发酵过程中总氨基酸均有一定的降低，进一步分析发现，在HJ的黄酒体系中总氨基酸的消耗量达到1.208 g/L，高于BY4743(0.696 g/L)，与模式菌BY4743相比，黄酒酵母HJ发酵醪中苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸的消耗量分别提高了65.3%、34.9%、76.5%。说明黄酒酵母HJ对于氨基酸的利用能力要高于模式菌BY4743。

2.2.2 黄酒发酵过程中游离氨基酸的变化

从图2可知，两株酵母发酵液中游离氨基酸的含量均随发酵时间的延长而增加，其中黄酒酵母HJ中的游离氨基酸在发酵结束时达到2700 mg/L，是模式菌BY4743的1.5倍。游离氨基酸在前酵期间的增加是由发酵醪中酵母产生的蛋白酶水解原料中的氨基酸导致的，而后酵期间游离氨基酸的增加是由于后酵期间部分酵母菌自溶，伴随着大量氨基酸和多肽产生[25]。

在黄酒发酵体系中，氨基酸释放的量主要由发酵醪中游离氨基酸的含量和微生物消耗的氨基酸含量组成。由图2可知，发酵结束后，黄酒酵母HJ发酵醪中芳香族游离氨基酸含量达到0.38 g/L，结合2.2.1中芳香族氨基酸的消耗量0.315 g/L可知，黄酒酵母HJ发酵醪中芳香族氨基酸的释放量为0.695 g/L，芳香族游离氨基酸的释放率达25.16%，其中有45.32 %的芳香族游离氨基酸被HJ用于自身代谢与芳香醇的合成，同理可知，BY4743的芳香族游离氨基酸释放率只有10.75%，其中有41.75%被BY4743用于自身代谢与芳香醇的合成。黄酒酵母HJ的芳香族游离氨基酸释放率是模式菌BY4743的2.34倍，说明相比较于模式菌BY4743，黄酒酵母HJ有更高的氨基酸释放率。

表2 发酵醪中总氨基酸含量变化

2.3 发酵过程芳香醇变化曲线

芳香醇是酵母合成细胞蛋白质时的副产物[14]，由于不同的酵母有着不同的理化特性，因此在相同条件下两株酵母产生的芳香醇也存在着一定的差异。如图3所示，两株酵母在前酵过程中芳香醇随着发酵时间的延长都有不同程度的提升，黄酒酵母HJ在黄酒发酵过程中3种芳香醇的含量均高于模式菌BY4743，前酵结束时，黄酒酵母HJ中β-苯乙醇、酪醇以及色醇的含量分别为100.71 mg/L、66.24 mg/L、2.05 mg/L，总芳香醇含量相比模式菌BY4743提高了20%。在后酵期间，两株酵母的发酵体系中芳香醇的含量均有所下降，RODMAN等[24]认为，当发酵温度低于30 ℃时，温度越高，发酵速度越快，因此后酵温度(16 ℃)不利于酵母的生长代谢，使酵母无法正常利用氨基酸来合成芳香醇，并且芳香醇具有一定的挥发性，由此导致了发酵中后期黄酒发酵醪中芳香醇含量的降低。

由2.2可知，相比较于模式菌BY4743，黄酒酵母HJ具有更高的氨基酸释放率和利用能力，这也使得黄酒酵母HJ总芳香醇含量比模式菌BY4743提高了20 %，说明除了选用不同品种的酿酒酵母来控制芳香醇之外，黄酒发酵过程中原料氨基酸的释放也是控制芳香醇浓度的重要切入点。

2.4 发酵过程中理化指标的相关性分析

本文对发酵过程中的指标进行相关性分析，相关系数以pearson相关系数为基础。前酵如图4所示。可以发现黄酒酵母HJ前酵过程中酒精度与酸度（r=0.9）、氨基态氮（r=0.76）、苯乙醇（r=0.92）、酪醇（r=0.99）和色醇（r=0.86）呈极强的正相关，这些物质均是酿酒酵母发酵过程中正常的代谢产物[29]，分析可知其产量有一定的相关性。黄酒酵母HJ发酵液中苯丙氨酸、酪氨酸与对应的β-苯乙醇（r=0.8）、酪醇（r=0.77）之间存在着强相关性，但是色氨酸与色醇的相关系数（r=0.09）并不高，由2.3可知，色醇在发酵前48 h的增长是很缓慢的，在发酵72 h才开始快速增长，从而导致了两者的相关性并不高。

由图5可知，后酵期间黄酒酵母HJ与模式菌BY4743发酵体系中芳香族氨基酸和芳香醇的含量均呈负相关。其中黄酒酵母HJ后酵过程中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸与β-苯乙醇、酪醇和色醇的相关系数分别为-0.42、-0.9和-0.92，这是由于后酵期间酵母大量死亡，体内的氨基酸释放到发酵液中，使得游离氨基酸的含量大量升高[25]，而芳香醇的合成需要完整的细胞结构，从而导致了后酵期间芳香族氨基酸和芳香醇的含量呈一定的负相关。

2.5 酸性蛋白酶活的变化

由表3可知，在发酵第24 h和120 h时黄酒酵母HJ发酵醪中的酸性蛋白酶活均显著高于BY4743（P＜0.05），分别为3.39 U/g和13.33 U/g，是BY4743的2.04倍和3.11倍。由于酸性蛋白酶具有超强的蛋白质内切和外切酶活力，可使自由氨基氮快速释放[28]，因此较高的酸性蛋白酶活是黄酒酵母HJ芳香族游离氨基酸释放率高于BY4743的主要原因之一，可以通过控制黄酒发酵过程中酸性蛋白酶的含量以及酶活的高低来控制原料中游离氨基酸的释放，从而控制黄酒中芳香醇的含量。

表3 发酵醪中酸性蛋白酶酶活变化

3 结论

芳香醇是影响黄酒及料酒香气的重要化合物，其浓度对产品品质影响较大。探究黄酒酵母产芳香醇的差异及影响因素，为黄酒中芳香醇的调控提供重要的理论基础。本文通过对比分析添加不同酿酒酵母（黄酒酵母HJ和模式菌株BY4743）的黄酒发酵过程中理化指标，芳香醇和氨基酸的动态变化，发现在前酵过程中，芳香族氨基酸的释放与芳香醇的含量呈正相关。黄酒发酵结束时，HJ发酵醪中芳香族游离氨基酸的释放率达25.16 %，是BY4743的2.34倍，其中有45.32%的芳香族游离氨基酸被HJ用于自身代谢与芳香醇的合成，较高的氨基酸释放率和利用率也使得HJ芳香醇含量比BY4743提高1.26倍。在发酵第120 h时，HJ的蛋白酶活力是BY4743的3.11倍，结果表明，较高的蛋白酶活力使得黄酒酵母HJ有更强的芳香族游离氨基酸释放率和利用率，从而促进了芳香醇的合成。这也说明在黄酒发酵过程中除了选择优质的酵母来控制芳香醇含量外，也可以通过控制蛋白酶活力的高低来控制氨基酸的释放，从而达到控制芳香醇含量的目的，这对黄酒中芳香醇的调控具有重要的指导作用。