啤酒酵母特性对啤酒品质的影响及其选育方法

吴艾玲

（西华大学食品与生物工程学院，四川成都 610039）

啤酒是中国乃至世界上最受欢迎的含酒精饮料之一[1-3]，随着消费升级，消费者更加追求产品品质，对于原材料、生产工艺等要求提升，高端啤酒对消费者吸引力增加。消费升级必然带来产品升级的需求，丰富的产品线也可以提升企业的竞争优势[4]。

酵母是一种单细胞微生物，是在食品行业应用较为广泛的微生物，其中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是酵母菌中最重要、应用最广泛的一类，是发酵工业重要的微生物。在啤酒发酵过程中，酵母产生的酶将糖发酵生成酒精、CO2和其他一些影响啤酒风味和香气的代谢副产物，如酯类（特别是挥发性酯类[5]）、高级醇、有机酸等[6]。这些物质与酒花特有的香味混合使啤酒产生特殊的味道和口感。酵母菌种在发酵过程中直接影响发酵时间、降糖速度、双乙酰还原速度、发酵度等[7]，而这些因素直接影响到啤酒品质和企业生产成本。

提高啤酒发酵度、啤酒质量的关键在于酵母的选择，这是优化啤酒酿造工艺，提升啤酒品质的最根本、最有效的途径。啤酒酵母的选育途径主要有诱变[8-10]、杂交[10]、原生质体融合法[10-11]、基因工程育种[10，12]。本文详细介绍了酵母对酿造过程和啤酒品质带来的影响并综述了国内外利用酵母选育来优化酿造过程及提升啤酒品质的不同方法，以期能为啤酒企业优化啤酒酿造过程及提高产品质量提供新方法。

1 酵母对啤酒带来的影响

酵母属于兼性厌氧菌，在有氧和无氧环境下都能生存。酵母作为啤酒酿造的主要原料之一，它能将麦芽汁中的糖分发酵成啤酒，产生酒精、二氧化碳及其他中间代谢产物。因此，不同的酵母菌种有不同的生理特性，其本身的特性会对啤酒酿造过程和成品啤酒带来很大影响。

1.1 残糖

啤酒发酵过程中麦芽三糖不能被有效利用是啤酒发酵缓慢、残糖含量过高的主要原因。不同酿酒酵母菌株的麦芽糖代谢能力存在明显差异,对啤酒发酵度有显著影响。因此，代谢麦芽糖的能力可以作为对酵母菌株品质好坏的评价标准之一[13]。

酵母利用麦芽糖和麦芽三糖需要通过麦芽糖渗透酶和麦芽三糖渗透酶的作用运输到酵母体内。Sergio等[14]在2008年证明，带有MAL21、MAL31或MAL41基因（编码麦芽糖渗透酶）的酵母菌株无法有效的利用麦芽三糖（在VII号染色体上具有正常MAL11基因的酵母菌株没有在其基因座处编码AGT1通透酶的mal1g等位基因，因此无法利用麦芽三糖，MAL21和MAL31与其有高同源度），只有AGT1编码的渗透酶能够调节低亲和力的转运麦芽三糖的行为。因此，AGT1编码的渗透酶是酵母高效吸收和利用麦芽三糖的关键。Sergio等认为，导致酿酒酵母在以淀粉为基础的工业过程(如酿造)中不完全或延迟消耗麦芽三糖的原因仍然存在争议。Kristoffer等[15]发现没有缺失STA1的菌株能够利用麦芽三糖等低聚麦芽糖，还对糖化能力差的菌株的STA1开放阅读框和上游序列进行了排序，发现酿酒酵母中糖化能力差的菌株的STA1启动子缺失了1162-bp，因此降低STA1的表达能力。结果表明，STA1编码的葡萄糖淀粉酶在麦汁发酵过程中发挥了核心作用，

1.2 风味化合物（表1、表2）

表1 酵母代谢产生的主要风味化合物

高级醇是啤酒酿造过程中产生的副产物之一，也是啤酒关键风味化合物之一。啤酒中大约80 %的高级醇在主发酵期间由于酵母代谢产生，即是酵母在合成细胞蛋白质时形成。高级醇含量超过100 mg/L会使啤酒口味和受欢迎程度明显降低[23]。高级醇类、酯类和邻二酮类(VDKs)是由酵母产生的关键元素，高级醇类和酯类是可口的啤酒的主要成分，邻二酮类会造成异味。由于这些副产物将决定啤酒的最终品质，因此Eduardo[24]对酿酒酵母产生的酯类和高级醇类相关的研究进行了论述。Matsche等[25]对两种不同菌株（加州啤酒酵母和德国啤酒/科尔士酵母）进行发酵分析，结果发现香叶醇和香茅醇的浓度在两种酵母的顶部发酵液中有显著差异。

表2 不同酵母代谢产生风味化合物特征

在发酵过程中，温度的变化会严重影响酵母的生长及其代谢速率。因此，酵母需要有对环境的适应性，通过改变代谢状态来应对温度变化。提高主发酵温度可以缩短发酵周期，但酵母将产生大量的酯类、高级醇等挥发性物质，严重影响啤酒的风味[26]。

降低啤酒中双乙酰的浓度是啤酒酿造过程中一个昂贵而耗时的环节。由于双乙酰在啤酒中通常是不需要的，所以去除双乙酰是啤酒发酵过程的主要目标之一[27]。双乙酰是一种具有黄油味的邻二酮，是啤酒发酵过程中由酵母氨基酸合成途径得到的产物所形成的邻二酮(VDK)(双乙酰前体物质α-乙酰乳酸是在酵母细胞缬氨酸合成途径内形成,然后渗透到细胞外经非酶作用氧化脱羧形成双乙酰[28]），对啤酒的风味和香气有重要影响。随后，宋玉梅等[29]发现，锌离子作为促进挥发性酸醛类以及双乙酰等物质产生的重要金属离子，其对风味代谢物质也有影响。他们研究了酵母菌株YJ02，发现酵母胞内有机锌与大部分脂类代谢产物呈现显著正相关，与醛类、醇类呈现显著负相关。除了产生的有机物对啤酒风味带来影响，酵母成熟周期产生并在出芽周期中被吸收的H2S会掩盖啤酒中的理想风味。Kaneo等[30]发现，当H2S的浓度大于0.005 mg/L的感官阈值时，会产生异味，对啤酒质量有不好的影响。

风味稳定性是啤酒最重要的质量指标之一，而风味的稳定性与酵母的抗氧化性相关，活的啤酒酵母通过自身代谢就会产生大量抗氧化物质，其本身就是优良的抗氧化剂[31]。谷胱甘肽（GSH）具有抗衰老的作用，有助于提升啤酒的稳定性，其通常是酿酒酵母发酵代谢得到[32]。

1.3 后期操作

除了酵母在发酵过程中产生风味化合物外，其特性对啤酒后期操作也会带来影响。啤酒的工业生产以高温巴氏灭菌法结束，这个过程的目的是使作为发酵剂的酵母和潜在的腐败微生物失活，从而延长啤酒的保质期。因此，酵母孢子的耐热性影响了最后成品啤酒灭菌的效果，从而影响了其保质期限。Elham等[33]对啤酒中酵母子囊孢子的耐热性进行了研究，发现不同的酿酒酵母菌株具有相似的孢子热阻，将有助于设计适当的热巴氏灭菌条件。酿酒酵母糖化变种被称为超衰减酵母，由于其具有发酵啤酒中残留碳水化合物的能力，这会导致二次发酵从而使二氧化碳(CO2)增加，其后果包括啤酒的喷涌和酒瓶的破裂[34-35]。尽管如此，Hutzler等[36]发现不同类型的酿酒酵母在批量酿造方面具有很高的潜力，也可用于二次发酵或混合发酵，以生产具有特殊风味和或低碳水化合物含量的啤酒。

1.4 发酵速率

缩短啤酒发酵时间，提高发酵速率有利于降低生产成本，也可以提高啤酒企业竞争力。酵母特性对啤酒发酵速率也会有一定影响。

早在1984年，Saita等[37]发现铵离子作为蛋白质合成的底物，刺激了糖酵解，提高了酿酒酵母的发酵速率。Mayu等[38]研究发现，腺苷甲硫氨酸（Sadenosylmethionine，SAM）参与了糖酵解和酒精发酵的控制，外源腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）可提高麦芽糖合成培养基和高比重麦汁的发酵速率，它与底部发酵啤酒酵母的发酵速率有特定的关系。研究表明，腺苷激酶基因ADO1的缺失导致了酵母细胞中腺苷甲硫氨酸的积累，从而提高了在15 ℃高糖合成培养基中的发酵速率。

2 优化方法

如今，啤酒行业的竞争越发激烈，优化啤酒的发酵工艺是提升竞争力的关键。酵母是啤酒酿造的原料之一，而啤酒产生的风味化合物含量取决于酵母的代谢，因此科学家通过基因工程手段和传统育种对酵母进行选育从而改善了影响啤酒质量的不利因素。

2.1 基因工程法

基因工程方法是指人为地在体外将外源目的基因插入载体，构成重组DNA分子并将重组DNA分子转移受体细胞中扩增和表达，从而获得具有新遗传性状或产生新的基因产物的受体细胞。随着基因工程技术的发展及啤酒酵母基因组的不断阐明，为改善啤酒质量，人们对啤酒酵母菌种改良展开了大量的研究。

为降低成品啤酒的残糖含量，Liu等[39]将葡萄糖淀粉酶基因(GLA)整合到菌株基因组的α-乙酰乳酸合成酶基因（ILV2）上，从而构建重组巴斯德酵母菌株。发酵试验初步证实，与原始菌株相比，重组菌株发酵的麦芽汁中的双乙酰和残余糖浓度分别降低了65.6%和34.2%。在工业操作下，重组菌株的发酵啤酒的成熟时间也降低了。Kristoffer等[15]针对STA1启动子中缺失的1162-bp开发了一个新的PCR引物，根据STA1启动子中缺失的情况来区分高糖化性和低糖化性菌株。针对啤酒发酵过程中产生风味化合物，母茜[12]采用一种啤酒酵母工业菌株的总DNA为模板，采用自克隆技术得到新菌株，同材料菌株相比，其产生的双乙酰含量降低。Zhang等[40]利用工业啤酒酵母菌株S5作亲本菌株，以构建ATF1（编码乙醇乙酰基转移酶）过表达和BAT2（编码胞浆支链氨基酸转氨酶）缺失突变体。经检测得到，与亲本菌株相比，工程菌株的产酯和高级醇含量有显著增加。随后石婷婷等[41]通过同源重组敲除4倍体啤酒酵母α-乙酰乳酸合成酶部分基因(ILV2)构建缺失一个和两个ILV2等位基因的突变株QI2-1和QI2-2，经过啤酒发酵实验后得出此方法不会对酵母生长和啤酒发酵造成不利影响，并且显著降低了双乙酰的含量，具有一定的实际应用价值。孙中贯等[42]通过构建GAP1一个等位基因敲除菌株和GAP1两个等位基因敲除菌株，考察GAP1基因缺失对酿酒酵母高级醇代谢能力及发酵性能的影响。结果发现高级醇合成能力得到不同程度的减弱，重组菌株符合啤酒发酵的基本要求，具有一定的实际应用潜力，但重组菌株对麦芽糖的利用能力减弱，在未来的研究中还应该解决这个问题。

最近Farhana[43]研究得出CRISPR-PCD和CRISPR-PCRep是新型的基因组工程方法，为酿酒酵母的育种和基因组功能研究提供了一种更快速的操纵多染色体区域的手段。这给未来优化基因工程手段对酵母进行改造提供了新方法。

Mayu等[38]发现，细胞周期调控是影响啤酒酵母发酵活性的主要因素。酿酒酵母基因中的RIM15和CLN3是具有功能性的，因为与野生菌株相比，实验构建的RIM15干扰物和CLN3DPEST突变株具有更高的发酵速率。真贝酵母基因中RIM15和CLN3的影响是不确定的。在未来的研究中，确定这些基因如何影响底部发酵啤酒酵母的发酵性能将是非常值得去探索的。

2.2 传统育种方法

酵母细胞产生的各种芳香化合物的浓度和相对比例对啤酒的质量至关重要。科学家们通过杂交手段对酵母进行选育。Jan等[44]对301种不同的酵母进行了研究，他们将最好的产香菌株定向杂交产生了46个种内杂种。研究得出，通过非转基因的方法，大规模的近交育种可以获得直接用于商业用途的优质工业酵母，它们可以用来酿造新型果味啤酒，或帮助获得更美味的低酒精啤酒。随后Stijn等[45]通过对精挑细选的酿酒酵母(S.cerevisiae)(6株)和真贝酵母(S.eubayanus)(2株)进行大规模的机器辅助选育，培育出了31种新型种间杂交酵母。它们的芳香型与目前应用的啤酒酵母产生的芳香型显著不同。其中，杂交菌株H29产生了高浓度的乙酸异戊酯、乙酸乙酯、异戊醇和苯基乙酸乙酯，且该菌株的乙醛产量相对较低，这会提高啤酒的稳定性。但最后检测到啤酒产生了轻微的硫磺味，这一点还需要未来进行更深的研究。刘春凤[17]采用常压室温等离子体诱变技术（ARTP）对啤酒工业酵母M14进行诱变处理，再采用戒酒硫-甲吡唑双抑制剂平板对得到的诱变菌株进行筛选，复筛后经高浓乙醛驯养后得到乙醛含量降低的目的菌株。

葡萄糖阻遏效应是麦芽三塘不能被有效利用的原因之一。李红等[46]通过在以麦芽糖或麦芽三糖为唯一碳源并添加有2-DOG或N-乙酰-D-葡糖胺的培养基中培养酵母，从长出的菌落中筛选出抗2-DOG或N-乙酰-D-葡糖胺的突变菌株，即抗葡萄糖阻遏效应菌株，通过初筛以及复筛，选择出快速发酵酵母菌株。郝红炜等[18]将空间酿酒酵母ST28（由地面酿酒酵母GT28带入太空返回的诱变菌株）通过YEPD培养基分离纯化筛选出1株酿酒酵母ST28-61，在主发酵过程中产生的双乙酰含量较少，低于了国家标准，因此不需要后发酵工艺过程，能够解决我国酿造啤酒发酵周期较长的问题。汪志君等[47]采用紫外诱变方法对啤酒酵母进行处理，用乳酸平板、麦芽汁-碳酸钙平板、TTC上层平板进行显色分离，最终得到1株高级醇和双乙酰产量降低的菌株。Chen等[48]利用非基因工程手段，经过两轮的紫外诱变和特定的平板筛选方法得到了1株突变体，测定发酵液中GSH的含量和DPPH自由基清除率，得出突变体的抗氧化能力明显提高。随后李磊等[49]采用过氧化氢刺激lager型啤酒酵母，Tadpoling法（类似微型平板稀释涂布法）用于酵母的选育，最终获得1株抗氧化能力提高且活力稳定性较高的啤酒酵母菌株。这是因为活的啤酒酵母具有很好的还原活性，其本身就是优良的抗氧化剂。因此，筛选或选育综合抗啤酒风味老化能力提高的优良啤酒酵母菌株将成为有效解决啤酒风味稳定性问题和延缓啤酒老化的途径之一。但目前提高酵母抗氧化能力手段较为单一，且酵母抗氧化机制相关理论研究仍处在起步阶段，因此选育高抗氧化活性酵母的方法还值得进一步的改进和研究[49]。

Maduka等[50]从斯里兰卡的棕榈酒中分离得到18种酿酒酵母菌株。与对照菌株相比，它们在40 ℃，100 g/L葡萄糖的分批发酵培养基上生长产生的酒精浓度相对较高。其中有5种菌株能在45 ℃环境下产生酒精。而Serena等[51]则从非酿酒环境中（葡萄汁、面包、葡萄酒和苹果酒）分离得到12种菌株，通过实验室规模的发酵筛选，得到DBVPG 1058菌株最适合用于酿造啤酒。这些菌株产生了可观的酯类和高级醇类浓度，表明它们有潜力成为以独特口味为特征的啤酒新型酵母。一些酯类物质超过了感官标准值，表明所选的酵母菌株可以生产出带有啤酒花和焦糖味的果味啤酒。

3 展望

对于食品和饮料工业中使用的转基因生物的严重关注仍然是任何商业化的主要障碍。因此在未来的研究中，在规避基因工程技术带来的风险的同时，也要大力发展非基因工程手段进行酵母选育以及生物技术的应用。

近年来，科学家们应用固定化细胞技术来对啤酒酿造过程进行优化[52-53]。因为在连续发酵过程中细胞活力的丧失，在低发酵温度下酵母发酵能力的减弱，以及需要连续的繁殖和产品的连续过滤来分离细胞是现在啤酒酿造过程中存在的现象。固定化细胞生产啤酒的主要优点是提高了发酵生产力[54]。因此，在这样一个竞争激烈的市场中，固定化细胞技术(ICT)可以节省发酵时间从而提高啤酒生产力。

挑选优良的酵母菌种不仅可以保证啤酒的质量和口感，还能缩短发酵时间，大大提高了啤酒工业的竞争力。但在选育过程中仍然存在产生的不良影响。因此在未来还需要对酿酒酵母的基因组进行更深层的研究，从而得到更优良的产品，降低生产成本，提升市场竞争力。