景芝本土酿酒酵母的筛选与应用

刘 雪，赵德义，曹建全，刘林林，徐晶晶，李伟安

（1.山东景芝酒业股份有限公司，山东景芝 262119；2.山东省酿造食品生物发酵技术重点实验室，山东景芝 262119）

酿酒酵母是酵母属酵母的模式菌，广泛应用于白酒、葡萄酒行业[1]。目前，白酒行业普遍使用商品的活性干酵母来提高白酒出酒率。不同地区的本土酵母存在差异，从而影响酒的风味与香气。在葡萄酒生产中为了彰显其地域独特性，许多国家通过分离鉴定得到了适合本土葡萄酒产区的酵母菌株，应用后取得了显著效果。例如2010年Capece等[2]从西班牙各地区的葡萄园筛选了341株本土酿酒酵母，并将其中的两株进行了工业水平的发酵试验，得到了很好的应用效果。在白酒的生产中也存在酵母菌种的地域性差异，但本土酵母的筛选和使用还处于起步阶段，据文献报道，2014年孔宇[3]筛选了72株青稞酒本土酿酒酵母，并将其中对青稞酒产风味物质性能良好的酵母进行实验室固态组合培养，也取得了良好的应用效果。

景芝酒业近几年研究数据显示，长期使用商业酵母会破坏发酵环境中的微生物生态平衡，造成微生物比例失调，进而影响酒质。为改善因商业酵母的使用带来的系列问题，急需自本土环境中筛选1株优势酿酒酵母菌种来代替商业酵母在酿酒中的作用，保证出酒率的同时还可以平衡生态环境，使微生物之间互相协调，相互作用，提高产品品质，为提高我省乃至全国白酒行业对酿酒酵母的认识提供借鉴和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：发酵5 d、7 d、13 d的景芝酒醅样品，储存3个月以上的景芝中温曲、景芝包包曲。

YPD培养基：1 % Yeast Extract(酵母膏)，2 %Peptone(蛋白胨)，2 % Dextrose (glucose)(葡萄糖)，若配制固体培养基还应加入2%琼脂粉，以115 ℃、15 min进行灭菌；WL酵母培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；PCR使用的引物合成于上海生工生物工程有限公司。

仪器设备：DYY-6电泳仪，北京市六一仪器厂；C1000 PCR仪，美国伯乐；GELDOC XR+凝胶成像系统，美国Bio-Rad；数显酸度计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理方法

称取10 g样品于90 mL灭过菌的生理盐水中，室温条件下，150 r/min，振荡浸提30 min。吸取上清液，进行梯度稀释，取100 μL合适梯度的样品涂布于WL鉴别培养基上，30 ℃培养5 d，根据不同种属酵母在WL平板上的菌落颜色和形态挑选菌落[4]。

1.2.2 初筛

将挑取的菌落在YPD培养基上进行3次以上的划线分离，得到单菌落，按照酵母单菌落在WL培养基上培养7 d的形态特征进行初步的形态分类[4]。

1.2.3 复筛

将初筛得到的菌种接种到YPD液体培养基活化24 h后，按照1%接种量接种到5 mL无菌水中进行菌株饥饿处理7 d，然后接种到赖氨酸培养基中，27 ℃培养3～4周，观察菌株生长情况，留取不能生长的菌株进行下一步试验。

1.2.4 指纹图谱分析

玻璃珠法提取酵母基因组DNA[5]，使用优化的Interdelta引物[6]进行PCR扩增，反应体系：PCR Mix中加入模板1 μL，10 μmol/L引物各1 μL。反应条件[6]：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性30 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环35次，72 ℃延伸10 min。扩增片段在2%的琼脂糖凝胶上50～80 v电泳1 h，紫外成像仪上观察并拍照，得到酿酒酵母指纹图谱。

1.2.5 发酵性能测定

以相同的接种量（1×106CFU/mL）将分离得到的酵母接种至装有100 mL大米糖液的250 mL三角瓶中，然后安装用浓硫酸封闭的发酵栓，称重，置于30 ℃培养箱中静置恒温培养，每隔12 h取出，振荡称重并记录失重，当12 h失重量小于0.2 g时，停止培养。

1.2.6 耐受性检测

取1环酵母接种于装有3 mL YPD的液体培养基中，30 ℃静置培养48 h，无菌水调节酵母细胞数至1.0×106CFU/ mL，将筛选酵母与商业酵母按相同浓度同时接种到耐受环境中，培养48 h进行酵母数量的测定，通过酵母菌数量比较不同菌株耐受性的差异。

1.2.7 分子生物学鉴定

玻璃珠法提取酵母基因组DNA，采用26S rDNA D1/D2基因的扩增与测序进行菌种的鉴定[7]。

1.2.8 应用小试：实验室固态模拟发酵

分别将筛选的本土酵母和商业酵母按照相同的添加浓度添加到已拌入粮食和大曲的酒糟中，装入发酵袋后放置于厌氧盒内发酵88 d，发酵结束后对比分析酒醅的理化指标。

2 结果与分析

2.1 初筛

根据菌株在WL培养基上的形态特征将筛选得到的菌株分为22种类型，见表1。

由表1可知，景芝发酵环境中的酵母形态繁多，多达22种，其中第1、第8、第10、第19共4种形态的酵母数量最多，证明这4类酵母在酒醅和大曲中的数量上占有一定优势。

2.2 复筛

酿酒酵母不能够将赖氨酸作为唯一氮源，所以在以赖氨酸为唯一氮源的培养基上难以存活和生长，故通过赖氨酸培养基可对初步鉴定为酿酒酵母

的菌株进行复筛[8]。将初筛得到的138株酵母进行赖氨酸培养后，发现有95株酵母不能正常生长为酿酒酵母，能够正常生长的酵母便不作为下一步研究的对象。

表1 筛选酵母的形态分类

2.3 指纹图谱

图1为部分筛选酵母的指纹图谱，泳道20为商业酵母所呈现的条带，其他泳道为筛选的本土酵母条带，由图1可知，泳道1、2、3、4、7、12、13、15、19的条带明显与商业酵母的条带不同，其他泳道条带类似于商业酵母，不排除跟商业酵母是同一菌株，因此将指纹图谱相同或相类似的菌株排除。通过Interdelta PCR指纹图谱法，共计筛选获得景芝本土酵母51株。

2.4 发酵性能测定结果

白酒出酒率主要受酵母菌的发酵力的影响[9]，对不同酵母发酵性能的考察，可以作为确定酿造过程中产酒酵母的重要指标。研究中对基因型不同于商业酵母的51株酿酒酵母进行了发酵力测定，测定结果发现，其中的33株酵母发酵力高于商业酵母，图2所示为其中发酵力较高的几株。

2.5 耐受性实验结果

窖池中的酿酒酵母会随着发酵的进行对所处环境条件越来越敏感，例如酒醅酸度、糖度、发酵温度、乙醇浓度等，因此筛选能够适用于这些极端环境的菌株十分重要。将发酵力高于商业酵母的本土酵母菌进行耐受性（耐高温、耐乙醇、耐酸、耐糖）测定，测试的耐受度是根据景芝本地酿造窖池中酒醅的极端条件而定，例如山东地区夏季窖池温度最高不超过38 ℃，因此耐受温度设为38 ℃，部分菌种的测定结果见表2。由表2可知，两株商业酵母均为耐高温、高度酒精、高糖、低酸的菌株，而筛选的本土酵母均不能耐受42 ℃高温，但大部分筛选的酵母在38 ℃下都能正常生长，不影响在本地区的使用，除此之外同时具备耐高酒精、高糖、低酸的本土酵母共计筛选出有26株。

2.6 菌种鉴定结果

为了进一步从基因水平上确定筛选酵母的种属，提取筛选的本土酵母基因组DNA，进行26S rDNA D1/D2基因的扩增与测序，测序结果提交NCBI进行Blast对比，结果显示筛选酵母均为酿酒酵母。

表2 耐受性试验菌数生长对比结果 (×105 CFU/mL)

表3 固态模拟发酵酒醅的理化指标

2.7 应用小试结果

将筛选的本土酵母和商业酵母分别培养，按照相同的使用量添加到酒醅中，装入发酵袋内进行固态模拟发酵88 d（浓香酒发酵周期），发酵结束后，分析酒醅的各项理化指标，分析结果见表3。

由表3可知，使用本土酵母发酵后，酒醅水分与不添加酵母和添加商业酵母的两组差异不大，但酒醅的酸度有所降低，平均为4.20H+mmol/10 g。实验组酒醅酒度最高可达5.28 %vol，比不添加酵母和添加商业酵母的两组分别高出11.16 %和11.39 %，由此可以推测出使用本土酵母后出酒率并不会降低反而有所升高。酯类物质分析结果显示，实验组乳酸乙酯整体平均值比不添加酵母组高5.4%，比添加商业酵母组低1.94%，而己酸乙酯整体平均值分别高20.66 %和17.20 %，由此可以看出，使用本土酵母比使用商业酵母更能达到增己降乳的效果。刘宁等[10]在研究葡萄酒本土酵母对葡萄酒的影响中也发现，本土酵母确实在发酵产酒的基础上会引起酒中酯类物质的变化，与本文的研究结果有一致性。以上数据显示本土酵母的优势明显高于商业酵母，经过进一步生产试验后可在景芝本土推广并逐渐取代商业酵母的使用。

3 结论

对本土酿酒酵母菌种资源的研究鉴定是优良酿酒酵母菌种选种、育种、优化的基础，对保存我国优良酿酒酵母菌种资源和开发工业菌种也具有重要意义[11]。为此，本研究对山东景芝本土酿酒酵母菌种进行分离筛选，并对其发酵特性进行研究，以期为本地优良酵母菌种资源研究奠定基础。本研究自山东景芝酿酒环境（发酵3 d、7 d、13 d的浓香酒醅、储存3个月以上的中温曲、储存3个月的包包曲）中分别进行分离筛选本土酿酒酵母，共计得到135株，利用WL培养基对酵母菌落形态进行分类，共计22类，利用赖氨酸依赖培养基进行复筛得到98株酿酒酵母，进一步利用分子生物学基因图谱分型，得到基因型不同于商业酵母的本土酵母51株，对其进行发酵力对比测定实验，发现有33株发酵力高于商业酵母，在此基础上，耐受性（耐高温、耐酸、耐糖、耐酒精）试验也较好的有26株。选取筛选的4株优势酵母经过分子生物学方法鉴定发现确为酿酒酵母，将4株筛选的酵母进行固态模拟发酵试验，实验结果证明，筛选的本土酿酒酵母应用效果良好。将本土酿酒酵母用于帘子麸曲制备，获得的酵母麸曲菌数可达10亿个/g，圆盘制曲可实现酵母数量25亿个/g，为将来实现本土酵母的推广使用奠定了基础。