对氨基苯甲酸与牛血清白蛋白相互作用的荧光分析

何文妮 ， 陈开意 ， 邵 波

(浙江树人大学 ， 浙江 杭州 310015)

紫外线吸收剂是一种可以用来吸收紫外线的有机紫外线屏蔽剂。近年来由于紫外线增强，有机紫外线吸收剂被人们大量使用，又通过多种途径将其带入水体，于是在水体中被检测出[1]。目前，各国已经普遍存在有机紫外防晒剂的环境污染问题，有机紫外防晒剂的残留几乎在所有类型的水体中都可以被检测到，并且浓度呈上升趋势[2]。水生生物能够不断地将有机紫外防晒剂累积在体内，通过食物链来产生生物放大作用，最终还有可能会产生环境类激素。一些常用有机防晒剂的毒性包括内分泌干扰效应、生殖、发育毒性及光致毒性等，影响水生生物的生殖、发育[3]。对氨基苯甲酸(PABA)、BP-1、BP-3等有机紫外线防晒剂对人或动物的雌激素、雄激素、孕激素和甲状腺激素系统会产生一定的干扰作用[4]。有研究表明，具有内分泌干扰效应的有机紫外防晒剂可能会对人体的健康造成一定的威胁[5]。含有荧光物质的分子与溶剂分子之间所发生的物理或化学作用，导致荧光强度或荧光峰位发生变化的过程被称为荧光猝灭作用。酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸都含有芳香环，所以它们都属于芳香族氨基酸，这也是蛋白质中荧光的主要来源。氨基酸残基在蛋白质与小分子发生作用时，会对微环境的变化变得十分敏感，这使得蛋白质的荧光强度或者荧光峰位发生改变，可以通过分析其荧光光谱的特征来了解二者之间存在的相互作用。往往可以通过研究有机紫外防晒剂与蛋白质之间的作用，而得知其在人体或动物体内的运输及分布情况，这也对于阐明有机紫外防晒剂的毒性有着重大意义。目前，现有文献报道有机紫外防晒剂与牛血清白蛋白的相互作用可以通过荧光光谱法来研究[6]。通过相关实验表明，当有机紫外线防晒剂与相关物质反应时能够利用荧光效应进行检测，因此本实验拟用荧光猝灭的方法来探究对氨基苯甲酸与牛血清白蛋白分子间相互作用的荧光分析，以应用于实际。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

F-4600型荧光分光光度计，日本日立，AL204型Mettler Toledo仪器(上海)有限公司；BCD-216ZDJ型的冰箱，青岛海尔股份有限公司；DK-8D型数控超级恒温槽，上海森信实验仪器有限公司；Paoifio-T-2-20型纯水机，PHSJ-4F型PH计，上海精科实业有限公司。

PABA，上海生物工程有限公司，进口分装，100g，纯度>99%，BSA，上海生物工程有限公司，用Tris-HCl缓冲液配制 1×10-5mol/L的BSA溶液。实验所用水为超纯水。

1.2 实验方法

对氨基苯甲酸溶液(1.0×10-2mol/L)的配制：取0.137 14 g的对氨基苯甲酸，用超纯水溶解，100mL的容量瓶中稀释定容至刻度线，摇匀后，放于4 ℃冰箱中保存。

0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲溶液：称取24.228 g的Tris药品倒入1 L的大烧杯内，加入超纯水溶解，将超纯水加至约700 mL，用浓HCl调节pH值至6.25±0.05，最后用超纯水1 000 mL的容量瓶中稀释定容至刻度线，摇匀后，放至室温下。

牛血清白蛋白(BSA)溶液(1.0×10-5moL/L)的配制：取0.068 g BSA，用Tris-HCL缓冲溶液溶解并定容于100 mL容量瓶中，并于5 ℃保存备用。

1.3 荧光猝灭实验

在10 mL比色管中分别加入5 mL的BSA溶液以及适量的PABA溶液，用超纯水定容并摇匀，使PABA的终浓度分别为 0、1.8×10-4、2.7×10-4、3.6×10-4、4.5×10-4、5.4×10-4、6.3×10-4、7.2×10-4mol/L。摇匀后，静置25 min使溶液混合均匀并充分反应，再倒入石英比色皿中，放入荧光分光光度计中，设定参数(光谱通带10 nm，λex=280 nm，λem=345 nm，扫描速率=240 nm/min)，测定荧光分光光谱。

1.4 同步荧光实验

在298 K的温度条件下，按照与荧光猝灭相同的实验原理，设定同步荧光的测定参数，即分别扫描在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm两种试验条件下，在250～350 nm内样品溶液的同步荧光光谱。

2 结果与讨论

2.1 荧光猝灭光谱

2.1.1不同浓度梯度下PABA对BSA的影响

蛋白质大分子之所以可产生较强的内源性荧光，是因其具有酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)等小分子结构。当蛋白质分子与外源性化合物互相作用时可能会降低蛋白质的内源性荧光强度。BSA的内源性荧光峰位呈现出有规律地下降，表示发生了荧光猝灭作用。同时BSA的内源性荧光强度随着对氨基苯甲酸浓度的升高，呈有规律性的降低，并且激发峰与发射峰的位置与形状几乎是一致的，这说明对氨基苯甲酸与牛血清白蛋白分子发生反应时存在着荧光猝灭的作用。

在298 K温度下，向BSA中分别加入不同浓度的PABA后，BSA在345 nm附近荧光强度最强，出现了荧光峰值；蛋白质的荧光发射峰随着PABA浓度的升高，发生了明显的猝灭现象，荧光峰值的位置却没有出现明显的变化。这是由于加入的PABA与 BSA发生荧光猝灭作用，致使其内源性荧光峰值有规律地下降，且BSA的荧光猝灭程度随着PABA浓度的升高在不断地加剧。298 K时PABA与BSA发生的荧光猝灭作用见图1。

图1 PABA对BSA荧光猝灭的影响

2.1.2作用时间的影响

在298 K条件下，BSA的浓度1.0×10-5mol/L，在激发波长为280 nm时，345 nm处测定加入一定量的PABA对BSA荧光猝灭作用的强度随时间的变化如图2所示。

图2 PABA对BSA荧光猝灭作用随时间的变化

由图2可知，PABA与BSA的反应，荧光强度在刚开始时最强，到25 min时，反应已经趋于稳定，因此在反应25 min后可以测定。

2.1.3pH值的影响

在pH值为3.75～9.05时，分别测定加入PABA前，BSA在Δλ=15 nm下的同步荧光光谱和加入PABA后，BSA在Δλ=15 nm下的同步荧光光谱，分析两者的荧光差值ΔF与pH值之间的关系，可以看出PABA对BSA色氨酸残基在不同pH值条件下荧光峰值的影响[7]，见图3。

图3 PABA对BSA荧光猝灭作用随pH的变化谱图

由图3可知，在加入PABA前与加入PABA后，BSA色氨酸残基在345 nm处相对荧光峰值变化较大的是在pH值=5～8时，所测得的ΔF的变化最大，是在pH值=6.0～6.5，因此本文将pH值=6.25作为工作酸度。

2.2 确定牛血清白蛋白参与反应的基团

有研究发现，能发射荧光的氨基酸残基存在于BSA分子中，例如酪氨酸残基、色氨酸残基和苯丙氨酸残基等。色氨酸残基、酪氨酸残基和苯丙氨酸残基这三者的相对荧光峰值比值为100∶9∶0.5，此处苯丙氨酸残基相对于色氨酸残基、酪氨酸残基而言可以忽略不计，因此主要是色氨酸残基与酪氨酸残基影响BSA的荧光光谱的峰值[8]。为探究是哪种氨基酸残基对BSA分子产生影响，需要进行荧光猝灭反应。

2.2.1在不同pH值条件下，PABA对BSA的酪氨酸残基的影响

在pH值为2.75～9.05时，分别测定加入PABA 前，BSA在Δλ=15 nm下的同步荧光光谱和加入PABA后，BSA在Δλ=15 nm下的同步荧光光谱，分析两者的荧光差值ΔF与pH值之间的关系，可以看出PABA对BSA酪氨酸残基在不同pH值条件下荧光峰值的影响[9]。如图4所示。

图4 不同pH值条件下，PABA对BSA的酪氨酸残基的同步荧光光谱图

加入PABA前与加入PABA 后，BSA酪氨酸残基在Δλ=15 nm下的相对荧光峰值基本上没有表现出任何变化，并且PABA与BSA分子两者的反应不因pH值的改变有所影响，因此可以排除掉BSA的酪氨酸残基参与到此荧光猝灭反应中来的可能。

2.2.2在不同pH值条件下，PABA对BSA色氨酸残基的影响

在pH值为4.50～9.05时，分别测定加入PABA前，BSA在Δλ=60 nm情况下的同步荧光光谱和加入PABA后，BSA在Δλ=60 nm情况下的同步荧光光谱。如图5所示。ΔF为加入PABA前后的荧光差值，分析ΔF与pH值之间的关系，可以观察到在不同pH值条件下猝灭剂(PABA)对BSA色氨酸残基荧光峰值存在不同程度的影响[10]。

图5 不同pH值条件下，PABA对BSA的色氨酸残基同步荧光光谱图

由图5可知，加入PABA前与加入PABA后的荧光差值，在Δλ=60 nm的情况下，BSA色氨酸残基的ΔF在pH值为6.0～7.5时存在着较为明显的变化，并且在pH值6.0～6.5内的变化最显著。因此可以说明，在相对适宜酸度的情况下，BSA色氨酸残基参加了猝灭反应。由此可以推测出主要是因为PABA与BSA的色氨酸残基发生反应，所以PABA与BSA分子反应时发生了荧光猝灭作用，从而导致了BSA荧光强度的降低。

2.3 荧光猝灭类型的判断

2.3.1动态猝灭

通常产生荧光猝灭的原因有动态猝灭、静态猝灭及动态和静态的联合猝灭[11]。动态猝灭是激发态荧光分子(例如BSA)与猝灭剂(例如PABA)两者产生碰撞，降低了前者自身的荧光峰值的过程。碰撞猝灭属于荧光动态猝灭中的一种，即处于激发态的荧光分子(BSA)与猝灭剂分子(PABA)产生碰撞，激发态荧光分子将热量释放到环境中，最后又以无辐射的方式跃迁回到基态而产生的猝灭作用。其规律遵从 Stern-Volmer 方程[12]：

(1)

式中，F是加入不同浓度药物后的荧光峰值；F0为未加入猝灭剂时的荧光峰值；Kq为静态猝灭常数；τ0为不存在猝灭剂时BSA的平均寿命；[Q]为药物的浓度；KSV为动态猝灭常数。根据上式所得的结果，以[Q]为横坐标，F0/F为纵坐标作Stern-Volmer图。生物大分子的荧光存在时间一般为10-8s，可以用来计算猝灭速率常数，结果如图6所示。cBSA=1.0×10-5mol/L；pH值=6.25。

图6 PABA与BSA反应的Stern-Volmer图

根据上述方法测得Kq为19.6×1010L/mol·s，>2.0×1010L/mol·s的经验最大值，因而可推测出并不是因动态猝灭而导致PABA对BSA分子荧光的猝灭。

2.3.2静态猝灭

基态荧光分子跟猝灭剂两者相结合而形成不发荧光的物质，且该物质会降低基态荧光分子的荧光峰值，该过程为荧光静态猝灭，可通过Lineweaver-Burk双倒数方程进行表示[13]：

(2)

式中：F0为加入猝灭剂前的荧光峰值，F为加入猝灭剂后的荧光强度；复合物在静态荧光猝灭时所生成的形成常数为K，单位是L/mol，[Q]为荧光猝灭剂的浓度，可以通过K来反映静态猝灭过程中在结合反应平衡时的量效关系。

注：cBSA=1.0×10-5mol/L；pH值=6.25

在一个供体荧光分子与另一个受体荧光分子的激发光谱发生重合的情况下，供体荧光分子的激发会使得受体荧光分子发出荧光，而供体荧光分子自身的荧光峰值却在降低，这便是荧光能量转移的过程。荧光能量转移具有辐射能量转移与非辐射能量转移之分。若要判断是否有辐射能量转移的发生，就要观察荧光猝灭光谱图的形状是否正常。如图7所示。BSA的荧光光谱的形状正常，表示并没有发生畸变，因此PABA与BSA之间的能量转移不属于辐射能量转移。非辐射能量的转移方式也分为两种，即分子内能量转移与分子间能量转移。综上所述可以推测，BSA荧光供体与PABA荧光受体它们两者之间应该是形成了复合物，PABA与BSA之间的能量转移为分子内的能量转移。

2.4 结合位点数

为了计算对氨基苯甲酸在BSA上的结合位点数，可运用Double-Logarithm公式进行计算。假设PABA与BSA能形成含n个结合位点的复合物，且该复合物不发荧光，条件稳定常数为K，根据化学平衡及荧光强度与浓度的关系可得[14]：

(3)

式中：F0无猝灭剂(PABA)时的荧光峰值；F为有猝灭剂(PABA)时的荧光峰值；Ka，结合常数；n，结合位点数；[Q]，猝灭剂浓度，mol/L。

注：cBSA=1.0×10-5mol/L；pH值=6.25

PABA与BSA之间的联结位点数基本为1，这就说明PABA与BSA之间只存在一种类型的联结位点。

2.5 PABA与BSA的同步荧光作用机理

可用同步荧光作用来研究生物大分子发光官能团受外源小分子加入后微环境的变化。为了做到同时扫描激发波长的荧光光谱和发射波长的荧光光谱，我们可以用同步荧光法，普遍的荧光测定方法尚未做到这一点。之后以荧光强度为纵坐标，其设定的波长范围为横坐标来绘制荧光光谱图，称为同步荧光光谱法。由于酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)等氨基酸小分子结构是蛋白质可以发出内源性荧光主要结构。普通光谱中不能明显地区分开两种内源性荧光的发射峰，因此不能获得精确的荧光数据，然而同步荧光光谱能够有效地将两者分开。不同浓度条件下的PABA作用于BSA时产生的同步荧光光谱图如图9所示。固定的激发波长与发射波长两者之间的差比可用Δλ来表示，酪氨酸残基的同步荧光光谱特征只在Δλ=15 nm的情况下表现出来，而色氨酸残基的同步荧光光谱特征只在Δλ=60 nm的情况下显示。在确定BSA的浓度后，逐步添加PABA的浓度，分别绘制在25 ℃下PABA与BSA反应时Δλ=15 nm、Δλ=60 nm同步荧光光谱图，结果如图10所示。

图9 Δλ=15 nm PABA对BSA的同步荧光

图10 Δλ=60 nm PABA 对BSA的同步荧光

图9、图10中，对氨基苯甲酸的浓度从1到8的分别为0、1.8×10-4、2.7×10-4、3.6×10-4、4.5×10-4、5.4×10-4、6.3×10-4、7.2×10-4mol/L，BSA的浓度始终为1×10-5mol/L。从图9、图10中可以看出，在加入PABA前色氨酸的最大峰高在400左右，结合同步荧光光谱可得，通过同步荧光光谱图可以了解到Δλ=15 nm时药物与BSA相互作用的荧光峰值基本低于Δλ=60 nm时的荧光强度，从而得出BSA中的色氨酸残基是引起BSA荧光强度变化的主要结构，并且色氨酸的最大峰值和牛血清蛋白的荧光峰值相接近，且变化趋势大致相近，由此可以判断PABA与牛血清蛋白的作用位置较靠近蛋白分子上的色氨酸残基。Δλ=60 nm时，PABA的峰位置都发生了一点偏移，位点发生了偏移说明了在的微环境条件下，色氨酸残基上存在的水溶性增强，疏水作用减弱，由此又可以推断出PABA能够改变BSA的分子结构，形成了一种新的构造[15]。Δλ=15 nm时，不同浓度的同步荧光光谱峰值不断减小，但是峰的位置并没有发生偏移。

3 结论

利用荧光光谱法研究了不同浓度、不同反应时间及不同pH值下对氨基苯甲酸与牛血清白蛋白分子间的相互作用。研究结果表明，PABA会使得BSA分子自身的荧光明显猝灭，这种猝灭作用会随猝灭剂浓度的升高而增强。PABA与BSA分子反应25 min时，BSA的荧光峰值在345 nm处已经趋于稳定，因此在反应25 min后可以测定。实验中ΔF的变化最大是在pH值=6.0～6.5 附近，因此本文将pH=6.25作为工作酸度。PABA与BSA的色氨酸残基发生反应，所以对于BSA荧光峰值有猝灭作用，从而导致其荧光峰值的下降，该过程为静态猝灭，即猝灭作用由二者形成了新的复合物而引起；PABA与BSA有较强的结合能力，可与BSA形成一个结合位点。综上所述，对氨基苯甲酸能与牛血清白蛋白分子能发生荧光猝灭作用。研究表明牛血清白蛋白与人血清白蛋白的同源性高达76.52%，通过本次研究提示，有机紫外防晒剂能在人体中通过血清白蛋白进行转运和储存，我们应当重视其对人体的可能存在的危害[16]。目前来看，还缺少对有机紫外防晒剂等个人护理品成分对人体非靶标组织细胞影响的足够认识，今后仍需要深入探究个人护理品成分在人体(特别是婴幼儿以及孕妇等敏感人群)内暴露情况，从而进一步阐明其对人体可能存在的健康风险。