人胃癌细胞BGC823 中miR-200c 靶基因产物波形蛋白的检测及功能研究

杨翠萍 ，杨晓金，杨燕萍，张梦茵，谢 玲，俞骁珺，蔡波尔，陈登宇，陈 平，吴云林

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院北院消化科，上海 201801；2.江西省九江市第一人民医院感染控制科，江西 九江 332000；3.江西省九江市妇幼保健医院检验科，江西 九江 332000；4 .安徽省蚌埠医学院病原生物学实验室，安徽 蚌埠 233030）

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，其发病率有逐年增高的趋势，肿瘤的复发、侵袭和转移将导致治疗失败[1]。据统计，2014 年全国新确诊的胃癌病例数达410 例，约占全部癌症发病的11%，发病率为30.00/10 万[2]，现已位居我国高发且死亡率高的恶性肿瘤前三位。近年来，胃癌的新发患者呈年轻化趋势，因此对于胃癌的防治，势在必行。胃癌的防治关键在于“早”，即早发现、早诊断、早治疗，故而寻找胃癌早期检测靶点至关重要。

研究表明，微小RNA（microRNA,miRNA,miR）可调节细胞染色体基因DNA 的转录表达[3]，在胃癌细胞的生长增殖、侵袭及转移过程中发挥作用。研究表明，miR-200 家族与肿瘤的侵袭、转移有关，对肿瘤细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT） 相关基因锌指E 盒增强子结合蛋白（zinc finger E-box enhancer binding protein,ZEB）的转录调控发挥重要作用[4]。研究提示，miR-200家族与其靶基因ZEB2、ZEB1 构成双向负反馈环，调节与肿瘤细胞移动、侵袭、转移相关的EMT 进程，可作为基因治疗的分子靶点用于临床诊疗[5]。针对miR-200 家族的研究将有助于选择有效的分子调控靶点对肿瘤进行治疗。EMT 标志物之一波形蛋白（vimentin）的表达增加与肿瘤侵袭相关，可促进细胞的运动，为预测肿瘤细胞的分化程度及患者预后提供依据。在其他肿瘤如乳腺癌、黑色素瘤等的EMT 相关研究中，已有波形蛋白与疾病的进展及预后相关的报道，但其在胃癌中的研究则相对匮乏。本研究拟检测人胃癌细胞BCG823 细胞系中miR-200c 的靶点，观察其对细胞功能的影响，并检测相关分子波形蛋白基因的表达情况。

材料与方法

一、材料

人胃癌细胞株BGC823 细胞购自中科院上海细胞所，Transwell TM 小室购自Corning Costar 公司，RNA 提取试剂盒、转染试剂购自Invitrogen 公司，实时定量PCR 试剂、噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）试剂盒及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自上海生工生物有限公司，G418 购自Sigma 公司，基质胶购自BD 公司，兔抗人ZEB2 抗体、兔抗人GAPDH 抗体购自Cell Signaling Technology 公司，质粒提取试剂盒购自Qiagen 公司。

二、方法

1.实时定量聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR）检测人胃癌BGC823 细胞中ZEB2 表达情况：引物设计参照相关文献及GenBank 中人ZE B2、β-actin 序列，应用引物设计软件，于基因不同外显子上设计正反义引物，引物序列及产物大小如下。ZEB2上游引物为5'-CCTCCCGACACTCT TGGCGA-3'，下游引物为5'-GGGCGAGTGGGCTTCCT-3'，产物大小为160 bp；β-actin 上游引物为5'-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3'，下游引物为5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'，产物大小为234 bp。将培养的人胃癌BGC823 细胞抽提总RNA，行反转录PCR或定量PCR 扩增ZEB2，以β-actin 作为内参。

2.重组质粒的构建鉴定及转染：参照文献[6]进行干扰质粒构建，ZEB2 的cDNA 序列见GenBank NM001171653.2，ZEB2 siRNA（#16704）购自Ambion（美国）。以干扰质粒pSUPER-EGFP1 为载体，针对ZEB2 基因构建干扰重组质粒shZEB2，后经基因测序验证构建成功。重组载体质粒转染胃癌BGC823细胞后，用有限稀释法及G418 耐药筛选稳定转染细胞株。同时构建阴性对照干扰质粒pSUPEREGFP1-Scramble shRNA（简称Scramble 重组质粒）。

3.蛋白印迹法检测ZEB2 蛋白和波形蛋白的表达： 分别收获野生型BGC823 细胞及转染shZEB2、Scramble 重组质粒的胃癌BGC823 细胞各5×105个，裂解细胞，离心后取上层清液，获得细胞裂解蛋白；测定蛋白浓度，采用蛋白印迹法检测蛋白表达水平。在110 V 恒压电流下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5 h，后转移至聚偏二氟乙烯膜上2 h，用5%牛奶封闭1 h；分别加入兔抗人ZEB2 抗体（1∶1 000）、波形蛋白抗体（1∶1 000）兔抗人GAPDH 抗体（1∶2 000），4 ℃下孵育过夜；洗涤3 次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室温孵育1 h；洗涤3 次，用电化学发光法检测ZEB2 蛋白表达情况。

4.MTT 法检测BGC823 细胞增殖能力：参照文献[6]将转染shZEB2、Scramble 重组质粒的BGC823细胞分为shZEB2 实验组和Scramble 对照组进行实验。分别将不同转染细胞用含血清培养液配制成单细胞悬液，细胞计数后按照每孔10 000 个细胞接种于96 孔板，设立空白组。培养6 d，每天每组细胞各取6 孔，每孔加入0.5 g/L MTT 溶液；37 ℃条件下继续培养4 h，弃去上层清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，轻轻振荡以充分溶解结晶物。用酶联免疫吸附检测仪在波长490 nm 处测定各孔的吸光度（absorbance，A）值，以时间为横轴，A 值为纵轴绘制生长曲线。

5.Transwell 侵袭实验检测肿瘤细胞BGC823细胞侵袭力： 将转染的BGC823 细胞分为shZEB2实验组和Scramble 对照组进行实验。采用Transwell TM 小室基质胶（Matrigel）侵袭实验测定肿瘤细胞的侵袭力。参考文献[7]的方法，按照8∶1 的比例将无血清培养基与基质胶Matrigel 混合，放Transwell TM 小室于24 孔板内，将稀释好的Matrigel 150 μL 置于Transwell TM 上层。37 ℃处理1 h，待Matrigel 凝固后，每孔加无血清培养基300 μL，每孔种细胞2×104个；小室下层加含血清完全培养基600 μL 后，放在细胞培养箱中孵育。24 h 后分别取出小室，以磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution,PBS） 清洗3 次，用棉签刮除滤膜上的细胞，膜下面的细胞用甲醇固定；采用10 g/L 结晶紫染色15 min，用PBS 洗3 次；晾干后在倒置显微镜高倍镜下观察并拍照，同时用Image J 软件计数细胞。

6.划痕试验检测BGC823 细胞的迁移能力：将转染的BGC823 细胞分为shZEB2 实验组和Scramble 对照组进行实验。参考文献[7]的方法，将待观测细胞种于6 孔板中，待生长汇合成片后进行检测。更换成含50 mL/L 小牛血清的RPMI 1640 培养液，用无菌中号枪头在孔内划线，使划线处无细胞生长；在0 h、24 h 和48 h 时，分别在倒置显微镜相同位置下观察划痕、无细胞处的宽度，并拍照记录。采用公式愈合度=（原始划痕宽度-某时点划痕宽度）/原始划痕宽度×100%进行分析计算，判定细胞迁移能力。实验重复3 次。

三、统计学处理

采用GraphPad Prism 5.0 软件进行数据分析，用表示计量资料，组间比较采用t 检验。P＜0.05时认为差异有统计学意义。

结 果

一、稳定转染细胞克隆筛选

以含1 000 μg/mL 的G418、10%小牛血清的RPMI 1640 培养基初步筛选转染成功的细胞，随后在荧光显微镜下找出表达绿色荧光蛋白的阳性转染细胞克隆，以有限稀释法筛选得到阳性单个细胞克隆，随后培养获得稳定转染株。

二、转染后BCG823 细胞中ZEB2 蛋白表达

筛选得稳定转染细胞后，提取总蛋白经蛋白印迹法检测ZEB2 蛋白表达水平。结果显示，与野生型BCG823 细胞相比，转染了pSUPER-EGFP1-Scramble 质粒的BCG823 细胞ZEB2 蛋白表达与野生型基本相同，而转染shZEB2 质粒组细胞的ZEB2蛋白表达显著下降（见图1A）。实时定量PCR 结果亦显示，转染后胃癌细胞中ZEB2 mRNA 表达亦明显下 降 （见图1B），提示 转染shZEB2 质量后BCG823 细胞中ZEB2 蛋白表达明显降低，可用于后续功能性实验研究ZEB2 低表达时胃癌细胞BCG823 生物学性状的改变。

图1 转染后BCG823 细胞中ZEB2 表达

三、转染后胃癌细胞BCG823 增殖力检测

用MTT 实验检测转染后胃癌细胞增殖能力，结果显示，自第4 天开始，shZEB2 组较Scramble 组BCG823 细胞中肿瘤细胞增殖能力降低，差异有统计学意义（见表1）。该结果显示，ZEB2 低表达时胃癌细胞增殖能力降低（见图2）。

表1 不同时间细胞的增殖能力（个）

图2 MTT 实验检测转染肿瘤细胞增殖力

四、肿瘤细胞侵袭力检测

本研究采用Transwell 小室法检测肿瘤细胞侵袭能力，将肿瘤细胞种于Transwell 小室内24 h后，取出小室，采用结晶紫染色小室背面的基质胶，在高倍显微镜下观察小室背面基质胶里的细胞，了解肿瘤细胞侵袭情况。结果显示，shZEB2 组较Scramble 组的胃癌细胞侵袭力降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果提示，ZEB2 低表达时胃癌细胞在基质胶中的侵袭能力降低（见图3）。

图3 Transwell 小室基质胶肿瘤细胞侵袭实验

五、细胞迁移能力检测

0 h、24 h、48 h 时，分别在显微镜相同位置下观察划痕无细胞处竖线宽度，比较各时间划痕无细胞区域宽度，判断愈合度。由图4 可见，shZEB2 组较Scramble 组的胃癌细胞迁移能力降低，差异有统计学意义（P＜0.05），提示ZEB2 低表达时胃癌细胞迁移能力降低。

六、波形蛋白mRNA 检测

用实时定量PCR 检测波形蛋白mRNA 的表达，结果显示，转染shZEB2 组较Scramble 对照组胃癌BCG823 细胞中波形蛋白mRNA 表达量下降（P＜0.05），蛋白印迹法检测也得到了同样的结果。而波形蛋白表达量下降提示引起胃癌细胞侵袭能力减弱（见图5）。

图4 细胞迁移能力检测

图5 转染后BCG823 细胞中波形蛋白及其mRNA 表达

讨 论

EMT 是细胞发生分子转换，因细胞失去上皮特性而获得间质特性，继而具备运动性以挣脱细胞间黏附，并侵犯其他部位的过程。EMT 中上皮细胞即可获得间质样特性，表达EMT 标志物——促进细胞运动的波形蛋白增高等，亦可表达干细胞的标志物，也可形成干细胞样细胞[5]。胃癌细胞发生EMT可使肿瘤细胞获得间质化表型移动性增强，发生向外的扩散性运动，导致肿瘤的侵袭、转移，从而促进病情恶化，减短患者生存期。

一、miR-200 和ZEB 家族反馈调控

在病理条件下，各种EMT 程序的异常激活会导致纤维化和癌症转移。几种作用于EMT 通路下游的多效性激活转录因子被归类为EMT 的主调控因子，包括锌指转录因子的SNAIL（SNAI1 和SNAI2）和ZEB（ZEB1 和ZEB2）家族。研究证实，ZEB 蛋白与多种miRNA 之间存在重要的调控关系。miRNA 是一种小的非编码RNA，可与相应mRNA 中的30 非翻译区UTR 结合而使同源靶基因沉默，从而抑制翻译或mRNA 降解。

高度参与EMT 调控的miRNA 是miR-200 家族，其由5 个成员组成，形成2 个簇。miR-200b、miR-200a 和miR-429 在人类1 号染色体上聚集，而miR-200c 和miR-141 在12 号染色体上聚集，每个聚类表达为一个多顺时针转录本。在miR-200 家族中，结合特异性不同，miR-200a-141（subgroup Ⅰ）和miR-200b-200c-429（subgroup Ⅱ）的种子序列不同。在最初的研究中，miR-200c 与ZEB125、miR-200b与ZEB226 在培养的癌细胞中呈负相关关系。miR-200 家族对ZEB1 和ZEB2 的抑制导致关键上皮标志物E-cadherin 表达增强，并获得上皮表型[8-9]。此外，对NCL-60 细胞株的分析提示，miR-200 家族的表达被建立为上皮表型的标志物。随后一系列与EMT 相关的体外模型系统研究对24 个miRNA-200 家族成员进行了探索，在用转化生长因子β 或酪氨酸磷酸酶Pez 异位表达的MDCK 细胞诱导EMT 时，miR-200 家族和E-钙粘连蛋白被抑制，同时ZEB1 和ZEB2 表达增加。转化生长因子诱导EMT的能力依赖于miR-200 家族的抑制和ZEB1、ZEB2表达水平。相反，miR-200 家族在原本是间充质细胞中的表达，可以诱导间质向上皮转化。这些结果证实了，miR-200 家族通过上皮表型的建立和维持来抑制ZEB1 和ZEB2 的表达，从而抑制EMT 的进展。

miRNA-200 家族对ZEB 表达的抑制是直接的，其发生是由于miRNA 结合到ZEB1 和ZEB2 mRNA 30 非翻译区盒子中的8 和9 这2 个位点[10-12]。已有研究在乳腺癌和结肠癌细胞系中发现了一个额外的miR200-ZEB 蛋白调控位点，其中ZEB1被shRNA 下调。细胞发生间质向上皮转化后，miR-200 家族相应上调，最显著的是miR-141/200c 转录本。miR-141/200c 启动子包含多个高度保守的E-盒子，这些E-盒子在间充质细胞中被ZEB1 占据，导致转录抑制。数据显示，ZEB1 缺失的细胞保留了上皮表型miR200 抑制，其建立了一个反馈回路，miR-200 与ZEB1 相互负控制对方的表达[13-14]。这一调控环的存在得到了证实，并进一步扩展到包括miR-200 家族的其他成员[15]。数据表明，大多数上皮细胞表达高水平的miR-200 家族，可直接抑制ZEB1 和ZEB2，从而使上皮钙黏素表达。然而，如果细胞外信号刺激了ZEB1 的表达，则miR-200 家族被抑制，EMT 得以继续进行。

miR-200-ZEB 循环与EMT 间的相关性已在体内得到证实。在p53-/Kras（G12D）肺腺癌模型中，miR-200 家族在转移易感性肿瘤和转移无能性肿瘤中差异表达最为显著。此外，在易转移的肿瘤细胞中，miR-200b 的高表达破坏了其在同基因小鼠中进行EMT 和转移的能力。同样，在胰腺神经内分泌肿瘤小鼠模型中，miR-200 家族成员的低表达是基因表达特征的一部分[16]。然而在临床样本中，miR-200a 和miR-200b 水平的升高及ZEB2 启动子的高甲基化，与不同形式的人类胰腺癌及慢性胰腺炎有关。最近一项乳腺癌研究显示，miR-200/ZEB循环在肿瘤进展中具有双重作用[17]。与胰腺癌标本一样，miR-200 家族成员在乳腺癌标本中的表达与肿瘤的转移、定植呈正相关，且在转移扩散率较高的细胞中表达升高。在原位乳腺癌模型中，建立肺转移模型需要增强这些miRNA 的表达。这与miR-200 家族成员的表达形成对比，miR-200 家族成员在体外降低肿瘤细胞的侵袭能力，在体内减少了肿瘤细胞在血液中的循环数量，表明miR-200 家族在癌症中扮演着一种新的双面的角色，一方面可阻止肿瘤细胞进入循环，另一方面又促进了肿瘤细胞在远处器官的定植[17]。

二、miR-200c 可抑制恶性肿瘤生长

研究表明，miR-200c 对不同肿瘤系有抑制作用。在多种恶性肿瘤如卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌等中，ZEB1 和ZEB2 与miR-200 家族构成双向反馈环调节上皮性肿瘤的EMT 能力[4,18-19]；降低miR-200c水平可提高Bmi-1 水平，从而促进黑色素瘤细胞的生长以及产生化疗抵抗性[20]。同时，降低的miR-200c意味着上皮性卵巢癌预后不良，因为miR-200c 可抑制上皮性肿瘤的EMT 转化能力，多种上皮性恶性肿瘤中miR-200c 减少，预示肿瘤多侵袭、转移，患者预后较差。此外，miR-200c 还可通过其他多种靶点抑制肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭及转移。miR-200c 对肿瘤细胞EMT 能力的抑制作用比较明确，但具体下游机制仍不完全清楚，有待深入研究。

上皮性恶性肿瘤中，肿瘤组织中的miR-200c表达水平较癌旁组织下降，在转移性癌细胞中更为明显，这与肿瘤细胞间质化表型的维持有关，miR-200c 表达下降导致了癌细胞的侵袭、转移及放化疗抗性增加[21-23]。诚然，尚有其他多种因素影响和调控着胃癌的发生、发展以及放化疗抗性[24-28]。

三、ZEB2 基因表达降低而miR-200c 升高条件下BCG823 胃癌细胞生长受抑制

本研究结果显示，降低人胃癌细胞株BCG823内ZEB2 基因的表达，miR-200c 表达升高，波形蛋白基因表达降低，胃癌细胞的迁移、侵袭及增殖能力均降低。可见，ZEB2 是miR-200c 的一个重要靶点，以期miR-200c 及其靶点ZEB2 用于胃癌侵袭、转移控制的分子靶向治疗，为胃癌的科学防治提供新策略，有关其具体机制尚待进一步深入研究。