风兰丛芽高效诱导及植株再生研究

丁长春 王元忠 黄衡宇 周 蓉

(1 云南中医药大学中药学院/云南省道地濒危中药材与栽培工程技术研究中心，云南 昆明 650500；2 文山学院环境与资源学院，云南 文山 663099；3云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650200；4丽江市古城区秋成种养殖有限公司, 云南 丽江 674100)

附生型兰科(Orchidaceae)植物是指附生于树干或岩石上的一类兰科植物，常生于热带地区。我国有附生型兰科植物70余属，500 余种，多为传统药用植物或民间中草药，风兰(Neofinetiafalcata) 亦是其中一种[1]。风兰为兰科风兰属(Neofinetia)植物，其植株较小，具有发达的气生根，总状花序生于叶腋，花序上可着生6～8朵花，花色多为白色或浅红色，单朵花的花期为7～10 d，整株花期可达1个月，花期多在每年3—4 月[2]。风兰主要分布在我国浙江、福建、江西、四川、云南北部和湖北西南部，日本、朝鲜半岛和琉球群岛也有分布[3-4]。据《中华本草》记载，风兰具有较高的药用价值，与多数药用附生型兰科植物不同，风兰以叶入药，含有较高的总黄酮量，还含有柠檬酸、苹果酸、草酸等有机酸，可治疗肺热咳嗽、咽喉疼痛和疝气等症，亦可作为跌打损伤外敷药材，效果良好[5-7]。

与其他兰科植物相似[8]，风兰种子细小，缺乏胚乳且胚发育不完全，萌发率极低，即使萌发成功，生长速度也非常缓慢；加之过度采挖和其生境的破坏，现已濒临灭绝，已被列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约》中的保护物种[9]。风兰传统上以分株繁殖为主，存在周期长、繁殖系数低等问题。而植物组织培养技术能有效地保护濒危和珍稀植物资源，对大健康产业的发展具有特殊且重要的意义[10]。目前，我国兰科植物的组培研究进展很大，主要集中在兜兰属(Paphiopedilum)[11]、杜鹃兰属(Cremastra)[12]、石斛属(Dendrobium)[13]等，而风兰属的研究报道很少；其中无菌播种仅见杨柏云等[14]的报道，茎尖培养则有胡如善等[15]、刘晓芳等[16]进行了研究，王裕[17]则对风兰的花梗腋芽进行了培养。有研究指出，种苗快速繁殖是实现濒危兰科植物资源再生和合理开发利用的有效途径，而其技术核心在于种子的无菌萌发[18]。本研究以无菌萌发获得风兰愈伤组织和原球茎混合物为材料，探索适合风兰快速繁殖的再生途径，采用单因素、完全组合和正交试验筛选适宜的激素组合、天然附加产物种类及浓度，以期建立风兰愈伤组织诱导、丛芽发生及植株高效再生技术体系，为保护其野生资源和发展人工栽培奠定技术基础，同时为其他兰科植物的组培快繁研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及前处理

风兰蒴果由云南文山学院丁长春博士提供；植株经云南中医学院黄衡宇教授鉴定为Neofinetiafalcata(Thunb.ex A.Murray) H.H.Hu。按地皮消蒴果消毒方法进行处理[19]，以其种子非共生性萌发后获得的愈伤组织和原球茎的混合物为材料进行试验。植物生长调节剂二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、激动素(kinetin，KT)、萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)、6-苄氨基嘌呤[N-(Phenylmethyl)-9H-purin-6-amine，6-BA]均为分析纯，购自北京鼎国生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基 基本培养基选用改良的MS + 活性炭(AC) 0.5 g·L-1，琼脂0.47%，pH值5.4～5.8。培养基于122℃灭菌20 min，备用。

改良的MS配方：硝酸铵(NH4NO3)、硝酸钾(KNO3)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O) 和二水氯化钙(CaCl2·2H2O)用量减半；糖20 g·L-1，其他成分不变。

非共生性萌发培基：参照云南省道地濒危中药材与栽培工程技术研究中心对其他附生兰的研究，采用改良的MS + AC 0.5 g·L-1为风兰种子非共生性萌发培养基。

1.2.2 单因素试验设计 在基本培养基中添加不同种类和不同质量浓度的植物激素，以及不同类型的天然附加产物进行单因素试验。其中，6-BA浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0 mg·L-1；KT浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5 mg·L-1；NAA浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5 mg·L-1；2,4-D浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5 mg·L-1。天然附加产物：苹果泥和香蕉泥浓度分别为30、50、80 g·L-1，椰子汁浓度分别为10%、20%、30%。愈伤组织和原球茎的混合物培养材料按0.5 cm×0.5 cm大小分割，每瓶5个材料，每组10瓶。培养室温度控制在22±1℃，光照强度1 500～2 000 lx，光照时间10 h·d-1， 90 d后观察各试验组风兰种子的生长情况，筛选适宜的植物激素、天然附加产物种类及其浓度范围。

1.2.3 正交试验及完全组合试验设计 正交试验：根据单因素试验结果，进行L9(34)正交试验，其设计见表1。愈伤组织和原球茎的混合物培养材料大小约0.5 cm×0.5 cm，每瓶6个材料，每组20瓶。90 d后，统计愈伤增殖系数和丛芽发生率。

完全组合试验：在基本培养基中添加不同质量浓度的 NAA 和苹果泥。其中，NAA 质量浓度分别设置为0.1、0.5、1.0 mg·L-1，苹果泥质量浓度分别设置为30、50、70 g·L-1。采用完全组合试验，将丛生芽中较大(2.5 cm以上)的苗单株切开，根剪去2/3，每个培养瓶6株，每组20瓶。培养室温度控制在22±1℃，光照强度1 500～2 000 lx，光照时间10 h·d-1，培养60 d后，统计各试验组风兰试管苗的生根率。

表1 L9(34) 正交试验设计Table 1 Design of L9(34) orthogonal test

1.2.4 炼苗移栽 待生根苗长至具有4～5片叶、根长2～4 cm时，将生根瓶置于室内炼苗3 d、室外炼苗3 d后，从培养基中取出幼苗，用清水小心洗净根部培养基，在质量浓度为0.1%的多菌灵溶液中浸泡5 min，取出晾至根部微发白时种植于温室内。基质为碎松树皮，使用前用质量浓度0.1%的百菌清杀菌消毒。保温(20～25℃)保湿(60%～80%)培养90 d后统计幼苗成活率及生长状况。

1.2.5 各项指标的测定分析 所得数据均采用Microsoft Office Excel和SPSS 19.0软件处理分析。

愈伤增殖系数=生长90 d 的有效愈伤组织转接块总数/刚接入时的有效愈伤组织块总数

(1)

丛芽分化率=产生丛芽的愈伤数/刚接入时的愈伤数×100%

(2)

丛芽分化系数=产生的丛芽数/转接时的愈伤数

(3)

生根率=产生不定根的单苗数/接种材料总数×100%

(4)

移栽成活率=成活苗数/移栽总苗数×100%

(5)。

2 结果与分析

2.1 凤兰种子非共生性萌发

播种30 d后，凤兰种子明显吸水膨胀，由最初的深褐色变成淡绿色(图1-A)；45 d后种子周围明显出现大量组织团(图1-B)，通过体视镜观察，推测为种皮破裂后产生的愈伤组织，进而分化为原球茎(图1-C)；75 d后，绿色原球茎增殖生长迅速，已基本覆盖培养基(图1-D)。

2.2 单因素预试验结果

单因素试验结果显示，天然附加产物是风兰愈伤增殖、原球茎分化的关键，在3个备选组中愈伤增殖速度和生长状况均优于其他外源激素，苹果泥效果最好，愈伤增殖系数可达3～4之间，原球茎也有明显分化。外源激素组中，NAA对愈伤组织的增殖效率优于2，4-D，其系数为2.5左右，较适合的浓度范围为0.1～1.0 mg·L-1，2，4-D浓度大于1.0 mg·L-1时，愈伤组织出现明显的早衰现象；而6-BA和KT处理组尽管在愈伤增殖上效果不理想(仅1.5左右)，但在原球茎发生效率上有较明显的效果，特别是6-BA处理组有新芽发生，其较适合的浓度范围为0.1～1.0 mg·L-1，但6-BA浓度大于1.0 mg·L-1时，愈伤组织则出现琉璃化现象。

注：A：播种30 d后种子开始转绿萌发；B：播种60 d后出现的组织团；C：播种60 d后体视镜下观察至的萌发情况；D：播种75 d后的愈伤和原球茎。Note: A: Green seeds begin to germinate after breeding 30 days. B: Tissue mass after breeding 60 days. C: The germination response after breeding 60 days observing using stereoscope. D: The calluses and protocorm-like bodies after breeding 75 days.图1 凤兰种子非共生性萌发Fig.1 The asymbiotic germination of N. falcata seed

2.3 正交试验结果

本研究通过正交设计筛选愈伤组织增殖和丛芽发生的最佳因素配比，在减少试验次数的同时，提高了试验准确度。以苹果泥(A)、NAA(B)和6-BA(C)为考察因素，进行L9(34) 正交试验，结果见表2。愈伤组织增殖系数极差结果表明，苹果泥为影响风兰愈伤组织增殖的最主要因素，其次为NAA和6-BA。这3个因素的极差均大于空白列(0.35)，说明在愈伤组织增殖方面这3个因素的效应都是可靠的。由方差分析(表3)可知，苹果泥对愈伤组织增殖系数有显著影响(P<0.05)，NAA和6-BA则无显著影响(P>0.05)；进一步Duncan检验结果(表4)表明，对愈伤组织增殖系数影响最大的是苹果泥水平1(30 g·L-1)，与水平2(50 g·L-1)和水平3(80 g·L-1)呈显著差异，其均值亦显著高于其他两个水平。通过平均值分析可知，风兰愈伤组织增殖培养中，最佳的因素组合为A1B1C2，即苹果泥30 g·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1。

由表2可知，对于风兰芽分化来说，6-BA是最主要的影响因素，其次为苹果泥和NAA。3个因素的极差均大于空白列(2.863)，说明6-BA、苹果泥和NAA浓度对芽分化率的效应均是可靠的。方差分析结果(表3)显示，6-BA对芽分化率有显著影响(P<0.05)，苹果泥和NAA则无显著影响(P>0.05)；进一步Duncan检验结果(表4)表明，对芽分化率影响最大的是水平1(0.1 mg·L-1)， 与水平2(0.5 mg·L-1)无明显差异，而与水平3(1.0 mg·L-1)有显著差异。通过平均值分析可知，风兰芽分化培养中，最佳的因素组合为A2B1C1，即苹果泥 50 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1+ 6-BA 0.1 mg·L-1。

表2 L9(34) 正交试验结果Table 2 Results of L9(34) orthogonal test

表3 凤兰增殖系数和芽分化率方差分析结果Table 3 Variance analysis results of multiplication coefficient and bud differentiation rate in N. falcata

表4 苹果泥和6-BA浓度水平的Duncan检验Table 4 Duncan′s test in three levels of apple butter and 6-BA

根据正交试验结果，结合风兰以愈伤组织培养为基础的实际情况，同时考虑减少步骤，缩短成苗时间等问题，本研究采用A1B1C2，即改良的MS + 苹果泥30 g·L-1+ 6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1+ AC 0.5 mg·L-1，作为愈伤组织增殖、丛芽分化和增殖同步培养基。

将愈伤组织转接至同步培养基中培养25 d后，愈伤组织明显增大，并伴随有疑为绿色原球茎颗粒的发生(图2-A)；转接40 d后愈伤组织进一步增殖，原球茎开始萌发，可见翠绿色芽点(图2-B)；转接70 d后愈伤组织已基本覆盖培养基表面，原球茎大量萌发，并有较粗壮的根产生，此时由于芽的大量发生挤压部分愈伤组织至培养瓶上部，失去培养基支持而微显发黄(图2-C)；转接90 d后芽生长迅速，具有2～3片幼叶和2～3条白色粗壮根(图2-D)，此时愈伤组织增殖系数达5.33，芽分化率100%，芽分化系数3.76。从愈伤组织增殖、芽发生过程来看，风兰愈伤组织具有强烈的胚性，每个愈伤上均可发生多个原球茎(图2-E)，原球茎先芽后根方式萌发为幼苗(图2-F)。同时，愈伤组织不断增殖，产生更多的原球茎，萌发后出现类似不定丛芽的情况(图2-G)。

2.4 凤兰芽的生长与增殖

将幼芽以3～4株为单位切开转接至改良的MS +苹果泥30 g·L-1+ 6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1+AC 0.5 mg·L-1中，转接25 d后基部愈伤组织开始增殖，幼芽叶片开始伸展(图3-A)；转接45 d后原球茎开始增殖，新芽和新根均出现，整个接种材料明显增大，未伸入培养基的新根具发白的根被层(图3-B)；转接60 d后接种幼芽明显伸长、叶片增多，每份材料基部均出现新芽，新根亦伸入培养基，根被呈绿色(图3-C)；转接90 d后，每份接种材料均有2～3株幼苗生长至2.5 cm，有4～6片新叶，基部愈伤组织不断增殖并出现由原球茎萌发出的新芽(图3-D)。风兰除了愈伤组织增殖、原球茎随之增殖和萌发外，接种50 d左右在主苗基茎处可见分蘖苗；培养90 d后转接时，分蘖芽可单独切开进行转接(图4 A～C)，进一步增大其繁殖效率。

2.5 风兰生根培养与炼苗移栽

完全组合试验结果(表5)表明，高质量浓度的生长素配合高质量浓度的苹果泥宜于风兰试管苗的生根培养。在苹果泥浓度一定的情况下，随着NAA浓度的增加，苗与根的健壮度提高，生根率也随之上升。

适宜于风兰试管苗生根的培养基为改良的MS + NAA 1.0 mg·L-1+ AC 0.5 g·L-1+ 苹果泥70 g·L-1， 材料培养10 d后，残留根未继续生长，新叶开始出现(图5-A)；培养25 d后试管苗明显长大，其基部开始产生1～2条淡黄色的粗壮新根(图5-B)；培养40 d后，试管苗叶片增多，不断从其基部产生新根，早期进入培养基的根呈绿色，后期发生的、裸露于培养瓶中的根具有明显发白的根被层(图5-C)；培养60 d后，试管苗根系粗壮发达，具有4～6片叶，生根率100%(图5-D)。炼苗后移栽至处理后的基质中(图5-E)，60 d后可见明显生长，成活率100%(图5-F)；大棚栽培第二年3月试管苗随即开花(图5-H)。<

注：A：转接25 d后愈伤组织块开始增殖；B：转接45 d后原球茎增殖；C：转接60 d后；D：转接90 d后。Note: A: Callus mass after being transplanted 25 days. B: PLB propagate after 45 days. C: Seedlings grow up after 60 days. D: Seedlings grow up after 90 d.图3 凤兰芽的生长与增殖Fig.3 Bud germination and multiplication of N. falcata

注：A: 转接50 d后基茎与根处出现分蘖芽；B: 70 d后的分蘖芽；C: 90 d后的分蘖芽。Note: A: Tiller buds germinate between caudex and root after being transplanted 50 days. B: Tiller buds after 70 days. C: Tiller buds after 90 days.图4 基茎分蘖芽的生长Fig.4 Germination of tiller buds on caudex

表5 不同浓度苹果泥和NAA对凤兰试管苗生根培养的影响Table 5 Influence of tube seedlings rooting culture caused by apple butter and NAA with different concentration in N. falcata

注：A：培养10 d后新叶开始出现；B：培养25 d后试管苗基部出现新根；C：培养40 d后的生根苗；D：培养60 d后的生根苗；E：培养刚移栽至基质中的试管苗；F：培养移栽60 d后的试管苗；G、H：开花试管苗。Note: A: Young leaves begin to germinate after breeding 10 days. B: Young roots germinating at the basis of tube seedlings after cultured 25 days. C: Rooting seedlings after 40 days. D: Rooting seedlings after 60 days. E: Tube seedlings just transplanted in matrix. F: Tube seedlings after being transplanted 60 days. G and H are the flowering tube seedlings.图5 凤兰生根培养与炼苗移栽Fig.5 Rooting culture, acclimatization and transplantation of N. falcata

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3 讨论

3.1 基本培养基类型对风兰组织培养的影响

KC、RE、VW、N6、R、MS、1/2 MS、1/3 MS、1/4 MS等基本培养基类型[20-26]已被广泛用于兰科植物的组织培养中。王裕[27]在对大叶风兰的组织培养研究中发现1/2 MS较MS的生根数量多；王建勤等[28]曾分别用VW、KC、MS及改良的VW、KC、MS对金线莲(Anoectochilusroxburghii)种子进行无菌萌发，发现种子在KC和改良的MS培养基上萌发率最高，但KC培养基上的原球茎较早就出现衰老。云南省道地濒危中药材与栽培工程技术研究中心在其他兰科植物的组培快繁研究中发现，附生兰与地生兰对基本培养基类型的要求不同(未发表资料)。在铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)中，改良的MS无论种子无菌萌发或随后的增殖和生根培养，均优于其他基本培养基(待发表资料)；而地生兰中的白及(Bletillastriata)则在1/2 MS中生长良好[29]。本研究结果表明，风兰与铁皮石斛类似，更适合以改良的MS作为基本培养基，这可能暗示附生兰对有机、微量等成分的需求高于地生兰类，还有待更多附生兰和地生兰种类的研究来验证。

3.2 外源激素种类及水平对风兰体外快繁的影响

在植物组织培养中发挥生物学效力最强的培养因素为外源激素，最常用的是生长素和细胞分裂素，如 6-BA、NAA、2,4-D和KT。本研究中，不同种类和质量浓度的激素直接影响着愈伤组织的诱导和增殖、原球茎分化及成苗。其中，2,4-D 和KT明显抑制了风兰愈伤组织诱导和增殖，导致愈伤组织变硬和褐化，不利于原球茎的产生和萌发；添加6-BA和NAA则能促进愈伤组织的生长和增殖，并可促进原球茎的发生和萌发。在风兰愈伤组织诱导和增殖中，单因素分析显示，外源激素对凤兰愈伤组织和原球茎生长的促进效果大小依次为NAA>6-BA>2,4-D 和KT，且适当浓度的激素组合明显优于单独激素。本试验结果表明，在风兰的培养中，6-BA和 NAA浓度比值在0.2～0.6之间时，愈伤组织的增殖率较高；两者比值接近0.6时，原球茎分化率较高。综合来看，在A1B1C2组合中，在愈伤组织具有较高增殖效应的同时也具有高效的原球茎分化和幼苗发生率，此培养基也适合进行芽的生长和增殖。本研究实现了风兰同步进行愈伤组织增殖、原球茎分化和芽增殖，达到了减少步骤，缩短成苗时间的目的。

3.3 风兰的增殖方式

有报道指出，兰科植物的离休培养过程中大多形成特有的原球茎或根状茎，极少有愈伤组织产生[30]。风兰种子的幼胚在培养基中吸水膨胀后，突破合点端种皮形成类似球形或椭圆形结构，进一步产生愈伤组织，经多次分裂形成胚性细胞团，再分裂形成原球茎。这种增殖方式在铁皮石斛中有过详细报道，愈伤组织可以分化出叶原基和顶端分生组织，最后形成不定丛芽[31]。与之不同的是，风兰不存在间接发生途径，愈伤组织发生后，一部分继续增殖，另一部分转变为胚性细胞团，直接分化为原球茎，并在培养基的营养支持下萌发成苗，产生类似“丛芽”的现象。本研究结果表明，风兰愈伤组织具有分化为体细胞胚(即原球茎)的潜力，通过对愈伤组织的增殖培养能获得大量的原球茎。因此，风兰愈伤组织和原球茎混和物可用作人工快繁以及种质资源保存的材料。

3.4 天然附加产物对风兰增殖和生长的影响

天然附加产物是兰科植物组织培养中常用的添加物，包括香蕉泥、土豆泥、苹果泥、椰汁、胡萝卜汁等，这些天然附加产物的添加在兰科植物的培养中，能增加增殖系数和培养效果[32]。但是，天然附加产物所带来的好处及机制并不完全清楚，有可能与其中含有植物激素、激素类似物或其他单一或混合物质有关[33]。本研究预试验以苹果泥、香蕉泥和椰汁作为添加物，发现3种添加物均对风兰生长具有促进作用，但香蕉泥会引起叶片失绿白化；椰汁表现为植株矮小和畸形，且褐化现象明显；苹果泥则不存在上述现象，在增殖与生根培养中具有明显促进生长的作用，尤其是愈伤组织增殖时起到显著效应，推测与其富含多糖、多酚类、维生素及矿物质等有关。天然附加产物在兰科植物组织培养中的具体作用，有待进一步深入研究。

4 结论

本研究从种子的非共生性萌发、愈伤组织发生和增殖、原球茎发生和增殖到丛芽增殖、生根及驯化移栽，建立了完整的风兰高效快速繁殖体系，在瓶苗增殖率和生根苗成活率等方面均较同类研究有了实质性提升，特别是分蘗苗繁殖可为无性系的建立提供快速有效的途径。同时，本研究在采样过程中发现，风兰野生活体材料带有一定数量的蒴果。目前，共生菌对兰科植物的种子萌发和幼苗发育已有一定的研究基础。进一步采用非共生萌发技术，可开辟风兰育苗的新途径，更好地促进该物种的保护与利用。本研究采用风兰种子作为外植体，后代存在很大的变异性。因此，未来的研究可利用单一原球茎进行单株无性系繁殖，为风兰优良性状的进一步人工选择提供丰富的素材。