甲基营养型芽孢杆菌BMF 04菌株的抑菌谱及对仁果类真菌病害的防治作用

万丹丹，吴海霞，汤曼丽，彭 云，陈 茹，马桂珍，暴增海*

（1.江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏连云港222000；2.南京医科大学康达学院，江苏连云港222000）

苹果轮纹病是由葡萄座腔菌属引起的，该病菌不仅会危害生长期的果树和果实，也会造成果实成熟期的烂果、落果，并且在贮藏期也会造成大量的烂果，是严重危害苹果产业的病害之一。除危害苹果外，还可侵染梨、桃、杏等多种果树，对果树的生长和水果产量造成了巨大的影响[1-2]。目前，我国轮纹病害的防治主要是依靠化学农药，而化学农药的大量使用和滥用导致了环境污染、生态多样性破坏、农药残留及植物病原菌产生耐药性等一系列难题[3]。开发利用新型生物农药可弥补化学农药的不足，微生物制剂用于植物病害的防治受到了广泛的重视[4-5]。芽孢菌属繁殖力强，其芽孢可在恶劣环境中存活，并且其产生的细菌素、抗菌蛋白、脂肽类抗生素等产物具有抑菌作用，被广泛地应用于微生物菌剂的研制[6-8]。用于植物病害防治的微生物菌株主要来源于陆地和海洋，其中来源于陆地的生物菌株开发应用比较普遍，而来源于海洋的微生物菌株，由于海洋特殊的生态环境，如高压、高盐、低温、寡营养等，造就了其产物的特异结构和活性是陆源微生物无法比拟的[9-11]。很多海源微生物的次生代谢产物对植物病害的防效更好，成为近年来的研究热点。

本课题组从连云港海域分离获得1株对轮纹病等多种植物病原真菌具有较强抑制作用的甲基营养型芽孢杆菌BMF 04菌株。为了进一步了解该菌株特性，笔者系统研究了该菌株及其发酵液的抑菌谱以及对仁果类轮纹病病害的防效，旨在为该菌株后续开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验菌株、培养基及果实来源

甲基营养型芽孢杆菌BMF 04由江苏海洋大学海洋微生物实验室分离、鉴定、保存。供试植物病原真菌（表1）和细菌保存在该实验室。

PDA马铃薯培养基；PD液体培养基；NA液体培养基；发酵培养基：麸皮1.0%，花生饼粉1.0%，CaCl21.0%，pH 7.5。

梨：市售雪梨；苹果：市售红富士。

1.2 BMF 04菌株及其无菌发酵液对植物病原真菌抑菌作用的测定

将4℃下保存的BMF 04菌株在无菌条件下转接于PDA斜面上，在28℃的条件下培养1 d进行活化；将4℃下保存的植物病原真菌在无菌条件下转接于PDA平板上，在28℃培养3 d进行活化，备用。

采用平板对峙培养法，在PDA平板中央接种直径为7 mm的病原真菌菌苔，在真菌三边距培养皿边缘25 mm处划线接种活化1 d的BMF 04菌株，以不接BMF 04菌株作为对照，3次重复。28℃培养3～5 d，观测并测量抑菌带宽度。

表1 BMF 04 菌株及其无菌发酵液对不同植物病原真菌的抑制作用测定结果

将甲基营养型芽孢杆菌BMF 04接种于PDA斜面，在温度为28℃条件下，培养16 h，用PD培养基洗下，制成菌悬液，接入装有60 mL种子液培养基的250 mL三角瓶中。在温度为28℃条件下，180 r/min摇床培养16 h，得到种子液，调整种子液浓度为108CFU/mL。按照10%的接种量，将种子液接种装入盛有60 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中；在温度为28℃条件下，180 r/min摇床培养48 h，发酵液冷却至4℃，以10 000 r/min转速离心20 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤去除菌体，即为无菌发酵液。

采用牛津杯法，将植物病原真菌接在直径90 mm的平板中央，在距边缘25 mm处对称放置4个牛津杯，3个牛津杯中各加入无菌发酵液200 μL，以发酵培养基为对照，重复3次。28℃下恒温培养4 d后，观察植物病原真菌的生长情况，并测量其抑菌带宽度。

1.3 BMF 04菌株发酵液对不同细菌抑制作用的测定

采用牛津杯法，将斜面培养24 h的5种供试细菌接种至盛有60 mL NA液体培养基的250 mL三角瓶中，28℃、180 r/min振荡培养24 h，制成浓度为106CFU/mL的菌悬液，取100 μL菌悬液均匀涂布在NA平板上，每个涂菌平板上等距离摆放4个牛津杯。牛津杯中加入200 μL BMF 04菌株的无菌发酵液，以等量的发酵培养基为对照，28℃下培养36 h，测定抑菌带宽度，重复3次。

1.4 BMF 04菌株发酵液及其无菌发酵液对梨、苹果果实轮纹病防治作用的测定

苹果、梨果实表面的处理:选择健康果形大小一致的苹果和梨的果实，对其表面消毒后，在果实的赤道处打直径为7 mm、深度为3 mm的伤口，每个果实3个伤口。用2种不同处理方法分别测定BMF 04菌株发酵液和无菌发酵液的保护作用和治疗作用。

保护作用：在伤口处分别用浓度为108CFU/mL BMF 04发酵液和无菌发酵液100 μL处理，以等量的发酵培养基为对照，16 h接种苹果轮纹病菌菌苔。

治疗作用：在果实伤口处接种轮纹病菌菌苔，16 h后分别接种浓度为108CFU/mL BMF 04发酵液、无菌发酵液100 μL。

将不同处理的果实放入相对湿度为95%左右、28℃的恒温培养箱中，观察5～7 d，采用十字交叉法测量病斑直径。每个处理设3重复，每个重复10个果实。

2 结果与分析

2.1 BMF 04菌株及其无菌发酵液对不同植物病原真菌的抑制作用

从表1和图1可见，BMF 04菌株对供试的26种植物病原真菌丝生长均具有明显的抑制作用，对23种真菌的抑菌带宽度达18 mm以上，其中对芒果炭疽病菌抑制作用最强，抑菌带宽度为28.67 mm，其次是小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、番茄早疫病菌，抑菌带宽度均超过27 mm。

图1 BMF 04 菌株对不同植物病原真菌的抑制作用

从表1和图2可见，BMF 04菌株无菌发酵液对供试的植物病原真菌均有抑制作用，对24种真菌的抑菌带宽度在10 mm以上，其中对苹果轮纹病菌和芒果炭疽病菌的抑制作用最强，抑菌带宽度分别为23.50 mm和23.00 mm，对水稻胡麻斑病菌和马铃薯晚疫病菌抑菌作用最弱，抑菌带宽度分别为6.67 mm和4.67 mm。

图2 BMF 04 无菌发酵液对不同病原真菌的抑制作用

2.2 BMF 04菌株发酵液对不同细菌的抑制作用

从表2和图3可知，BMF 04菌株对供试的金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，抑菌带宽度为20.55 mm，其次是青枯病菌，抑菌带宽度为11.83 mm，对大肠杆菌、角斑病菌和枯草芽孢杆菌没有抑制作用。

表2 BMF 04 菌株无菌发酵液对不同细菌的抑制作用

图3 BMF 04 菌株对不同细菌的抑制作用

2.3 BMF 04菌株发酵液及其无菌发酵液对梨、苹果果实轮纹病防治作用

从表3可见，经BMF 04菌株发酵液处理过的梨、苹果轮纹病病斑直径分别为21.03、18.03 mm，经无菌发酵液处理过的梨、苹果轮纹病病斑直径分别为24.60、22.60 mm，无菌发酵培养基为对照组的梨、苹果轮纹病病斑直径分别为43.10、53.87 mm；BMF 04菌株发酵液对梨、苹果的保护作用分别为61.15%、76.47%，无菌发酵液对梨、苹果的保护作用分别为51.24%、66.72%。以上结果表明，BMF 04菌株发酵液的抑菌作用明显优于无菌发酵液；BMF 04菌株对苹果和梨具有很强的保护作用，且对苹果果实轮纹病的保护效果优于梨果实上轮纹病的保护效果。

从表4可知，先接种轮纹病菌，后接种BMF 04菌株发酵液的梨、苹果轮纹病病斑直径分别为29.03、32.13mm，接种无菌发酵液的梨、苹果轮纹病病斑直径分别为34.17、36.77 mm，无菌发酵培养基为对照组的梨、苹果轮纹病病斑直径分别为44.53、59.10 mm；BMF 04菌株发酵液对梨、苹果的治疗作用分别为41.30%、51.77%，无菌发酵液对梨、苹果的治疗作用分别为27.67%、42.88%。以上结果表明，BMF 04菌株发酵液对苹果、梨轮纹病具有较好的治疗作用，且对苹果果实轮纹病的治疗效果优于梨果实上轮纹病的治疗效果。

对比表3和表4可以看出，海洋细菌BMF 04菌株发酵液及其无菌发酵液对苹果、梨果实的轮纹病都具有良好的防效，且该菌株对果实的保护效果优于治疗效果。

表3 BMF 04 菌株发酵液和无菌发酵液对梨、苹果果实轮纹病的保护作用

表4 BMF 04 菌株发酵液和无菌发酵液对梨、苹果果实轮纹病的治疗作用

3 结论与讨论

甲基营养型芽孢杆菌BMF 04菌株及其发酵液对供试的26种植物病原真菌和2种细菌均具有抑制作用，该菌株对23种真菌的抑菌带宽度达到了18 mm以上，无菌发酵液对24种真菌的抑菌带宽度达到了10 mm以上，其中对苹果轮纹病菌和芒果炭疽病菌的抑制作用最强，抑菌带宽度分别为23.50 mm和23.00 mm，说明其抗菌谱较广。目前，应用于植物防病促生的芽孢菌属主要为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等[12]，关于甲基营养型芽孢杆菌在植物病害的防治应用近年来也有所报道。甲基营养型芽孢杆菌BAC-9912、WF-3对黄瓜灰霉病和炭疽病的防效分别达78.8%、77.38%[13-14]。从海洋中分离筛选的甲基营养型芽孢杆菌SHB114和BH21，能有效抑制黄瓜枯萎病、炭疽病、立枯丝核菌和葡萄灰霉病[15-16]。分离自天然饼肥发酵液的甲基营养型芽孢杆菌4-L-16菌株在香蕉根际土壤和植物体内具有良好的定殖能力，是防治香蕉枯萎病的新菌种资源[17]。赵文珺等[18]室内盆栽实验表明，甲基营养型芽孢杆菌NK、G-1对番茄白粉病防效分别达87.55%、47.74%，且能不同程度促进番茄的生长。本研究中的BMF 04菌株与上述报道的菌株相比抗菌谱较广，抗菌种类也有明显不同。该菌株的发酵液和无菌发酵液对苹果和梨的轮纹病均具有防治作用，且保护效果优于治疗效果，发酵液的防效优于无菌发酵液的防效，对苹果的保护效果及治疗效果分别为76.47%、51.77%。

本研究说明甲基营养型芽孢杆菌BMF 04是一株具有广谱抗菌性的海洋细菌，对果实轮纹病具有良好的防效，在植物病害的微生物防治方面具有广泛的应用前景。