牦牛BNBD4 组织分布及其蛋白特性的研究

郑 姚，李 娟，王 利*，陈希文

（1.西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部和四川省重点实验室，四川 成都 610041；2.绵阳师范学院动物疫病防控与健康养殖工程技术研究中心，四川 绵阳 621000）

β 防御素是抗菌肽家族（Antimicrobial peptides，AMPs）重要成员，广泛存在于动植物体内，现已在人、鼠、猪、鸡、蓝狐和牛中发现β 防御素存在[1-5]。β 防御素是构成机体天然免疫的重要组成部分，被认为是防御细菌和真菌等侵入病原体的第一道防线，多存在于消化道与呼吸道[6]。在牛的舌头、气管、肠组织中分别发现了舌抗菌肽（Lingual antimi⁃crobial peptide，LAP）、气管抗菌肽（Tracheal antimi⁃crobial peptide，TAP）、肠溶性β 防御素（EBD）和β防御素4（BD4）。TAP 是β 防御素家族的第一个特征明确的成员，纯化后对多种细菌均具有抑菌活性[7]。Mossallam 等在水牛的气管组织中克隆鉴定出β 防御素10 和11[8]。从水牛乳汁中分离出的牛中性粒细胞β 防御素2（BNBD2）也显示出对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的显著抗菌活性[9]。牛中性粒细胞β防御素4（Bos grunniens neutrophilbeta-defensin 4，BN⁃BD4）属于β 防御素类，目前国内外仅对牦牛BNBD5基因的克隆与原核表达研究外，尚未见牦牛其他β防御素的报道。牦牛是世界上典型的长期生存于高原地区的物种之一，对多种疾病有较强的抵抗力[10]。牦牛不仅具有重要的经济价值，并且具有极大的科研价值。本实验克隆获得牦牛BNBD4 基因序列，检测其在牦牛不同组织中的转录情况，同时原核表达了BNBD4 蛋白，初步探究该蛋白的抑菌作用。本研究为深入探究BNBD4 在牦牛免疫系统中的防御机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织无菌采集自四川阿坝州红原3 岁龄3 头健康麦洼牦牛，液氮速冻后-80 ℃保存备用。DL2000 DNA Marker、1.1×T3 Super PCR Mix 和E. coli DH5α感受态细胞购自北京擎科新业生物技术有限公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit 和TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ均购自宝生物工程（大连）有限公司；抗His 标签鼠单克隆抗体和His 标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；山羊抗小鼠IgG-HRP、E. coli BL21（DE3）感受态细胞和ECL 发光试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 牦牛BNBD4 基因的PCR 扩增参考GenBank中黄牛BNBD4 基因序列（NM_174775.1），利用Prim⁃er Premier 5.0 软件设计引物P1（P1-F：TCTTCTC⁃CAGCATCAGCC/P1- R： CTGGTTACGCCTCAGTCT）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用RNAiso Plus 试剂处理并提取牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏5 种组织的总RNA，反转录为cDNA。以肺组织cDNA 作为模板，采用P1 引物进行PCR 扩增，PCR 反应程序为：98 ℃2 min；98 ℃2 min、 55.6 ℃10 s、72 ℃15 s，共35 个 循 环；72 ℃2 min。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。

1.3 牦牛BNBD4 基因生物信息学分析采用NCBI的ORF Finder 程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffind⁃er/）分析扩增的BNBD4基因序列，并预测其氨基酸序列。采用Megalign 软件进行序列同源性分析及进化分析。利用DNAMAN 软件分析BNBD4 氨基酸序列。采用ExPASy 子程序分析BNBD4 蛋白基本理化性质、亲疏水性、二硫键的位置。采用SignalP4.0、TMHMM、SOPMA、SMART SWISS MODEL 预测蛋白信号肽剪切位点、跨膜结构域、二级结构及三级结构。

1.4BNBD4 基因在牦牛不同组织中的转录情况

根据1.2 克隆获得的牦牛BNBD4 基因序列设计荧光定量PCR 引物P2（P2-F：CTTCCTGGTCCTGTCTGC/P2-R：AGGTGCCAATCTGTCTCAT），以β-actin 为内参基因，参考文献[11]合成牦牛β-actin 基因引物（P3- F： CTTCGAGCAGGAGATGGC/P3- R： CCGT⁃GTTGGCGTAGAGGT）。采用TB Green 荧光定量PCR法检测BNBD4 基因在麦洼牦牛心脏、肝、脾、肺和肾5 种组织中的转录情况。反应体系为10 μL，反应程序：95 ℃3 min；95 ℃10 s、53.4 ℃20 s、72 ℃30 s，39 个循环；65 ℃5 s、95 ℃3 min。每个样品均重复3 次。以肝脏扩增的Ct 值作为不同组织间差异定量分析的参照，采用2-ΔΔCt法分析结果，通过PSS24.0单因素方差分析其显著性，p<0.05 表示差异显著，p<0.01表示差异极显著。

1.5 原核表达重组质粒的构建与表达将PCR 扩增得到的BNBD4 目的片段克隆至pET-32a 载体的KpnⅠ/EcoRⅠ位置，构建重组质粒pET32a-BNBD4。获得的重组质粒经EcoRⅠ和MluⅠ酶切鉴定后，阳性质粒并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。将鉴定的阳性重组质粒转化E. coli BL21（DE3）感受态细胞，获得阳性重组菌培养至OD600nm为0.4～0.6 时加入终浓度为0.5 mmol/L IPTG，37 ℃诱导12 h，收集表达产物。分离上清与菌体沉淀，菌体沉淀用5 mL PBS 悬浮并破碎，收集上清与沉淀，用SDS-PAGE 检测重组蛋白的表达，并进一步以抗His 标签鼠单克隆抗体（1:4 000）为一抗，山羊抗小鼠IgG-HRP（1:10 000）作为二抗，进行western blot 鉴定。设转化空载体pET-32a 的重组菌作为阴性对照。

1.6 重组蛋白的毒性试验将重组菌pET32a-BN⁃BD4/BL21（DE3）培养至OD600nm为0.4～0.6 时以终浓度0.5 mmol/L IPTG 诱导6 h，以LB 液体培养基调整其初始浓度为5×108cfu/mL，按10倍倍比稀释获得5个浓度（5×104cfu/mL～5×108cfu/mL），每个浓度取5 μL涂布于LB 平板（含100 μg/ml Amp、0.5 mmol/L IPTG），37 ℃培养过夜，观察各组菌落数，分析BNBD4 对E. coli BL21（DE3）的毒性作用。以转化空载体pET-32a 的重组菌作为阴性对照。

2 结 果

2.1 牦牛BNBD4 基因的PCR 扩增牦牛各组织样品总RNA 经1%琼脂糖凝胶电泳检测均有28S、18S、5S 3 个条带（图略），OD260nm/OD280nm均为1.9～2.0，表明所提取RNA 可用。以牦牛肺各组织cDNA为模板，利用引物P1进行RT-PCR扩增基因结果显示，扩增得到约250 bp的BNBD4基因目的条带（图1）。测序后采用NCBI 比对结果显示其与黄牛相应基因同源性达97.44%。表明正确扩增了牦牛BNBD4基因。

图1 牦牛BNBD4 基因的PCR 扩增结果Fig.1 PCR amplification of BNBD4 gene of Bos

2.2BNBD4 基因序列分析利用ORF Finder 程序对BNBD4 基因序列分析结果显示，BNBD4 基因开放阅读框为195 bp，可编码64个氨基酸。采用MEAG5.0和Megalign 软件将牦牛BNBD4 基因与其他物种的该基因序列分析后构建系统进化树（图2），结果显示牦牛BNBD4与黄牛相似性达96.4%，与其聚为一板，与水牛相似性为87.7%。表明BNBD4 基因ORF 区高度保守，与黄牛亲缘关系最近，其次是与水牛。

将预测的BNBD4 基因编码的氨基酸序列利用Megalign 软件与NCBI 数据库中登录的黄牛、人、猕猴、犬等11 种物种的BNBD4 氨基酸比对结果显示，氨基酸序列在特定位置均含有6 个保守半胱氨酸残基；氨基酸序列同源性最高的是黄牛为82.7%，其次是水牛为64.2%，与大西洋鲑同源性最低为19.8%。表明BNBD4 在同属中具有高度的保守性。

图2 牦牛BNBD4 基因的进化树Fig.2 Nucleotide phylogenetic tree of BNBD4 gene

2.3 牦牛BNBD4 蛋白结构与功能预测采用在线工具ProtParam 预测牦牛BNBD4 的理化性质，结果显示其前体蛋白的分子量为7.3 ku，分子式为C325H521N99O75S9，理论等电点为11.17。含16 种基本氨基酸，其中含量最高的是Leu（14.1%）；带正电荷的氨基酸残基（Arg+Lys）总数为8，不含带负电荷的氨基酸残基；280 nm 的摩尔消光系数为11 375 mol/cm；该分子的平均亲水系数为0.463。表明BNBD4是阳离子型β防御素。利用ExPASy在线服务网站的Protscale工具对BNBD4 前体蛋白的亲疏水性进行预测分析结果显示，该蛋白aa10 具有最强的疏水性（最大值为3.511），aa30 表现出最弱的疏水性（最小值为-2.256），表明该蛋白在其N 末端信号肽形成较强的疏水区。

采用在线分析软件SignalP4.1 对BNBD4 蛋白的氨基酸序列的信号肽剪切位点进行预测，结果显示，该蛋白的N 端至第22～23 位氨基酸之间的剪切位点分值和综合剪切分值均达到最大峰值，表明该蛋白有信号肽结构可能为分泌蛋白。通过在线预测跨膜结构软件TMHMM Server v.2.0 分析BNBD4 编码的蛋白，结果显示BNBD4 氨基酸序列中存在1 个跨膜螺旋区域，分别位于aa7～aa25 之间，表明BNBD4在合成后通过信号肽的引导分泌到细胞外。利用在线软件SOPMA 对BNBD4 蛋白进行二级结构的预测分析结果显示，在BNBD4 二级结构中无规则卷曲占46.8 %，β-折叠占31.25%，α-螺旋占21.9%。利用Predict-Protein 服务器分析结果显示，6 个保守的半胱氨酸残基分别以Cys1-Cys3、Cys2-Cys4、Cys5-Cys6 连接，形成3 个分子内二硫键。采用SWISSMODEL 在线分析工具对BNBD4 进行同源建模，BN⁃BD4 结构域主要为无规则卷曲和β 折叠、α 螺旋结构，与二级结构预测结果一致。进一步证明了所克隆BNBD4 属于β-防御素亚家族。

2.4 牦牛不同组织BNBD4 基因转录水平检测利用荧光定量PCR 检测各组织中BNBD4 基因转录水平，结果显示，BNBD4 在麦洼牦牛心脏、脾脏、肌肉、肝脏、肺脏均有不同程度的转录，在肾脏中转录水平极显著高于心、肝、脾、肺组织（p<0.01），肝脏次之，在心脏、肺脏、脾脏组织转录水平较低（图3）。表明BNBD4基因转录情况具有组织特异性。

图3 BNBD4 基因在麦洼牦牛不同组织中的转录水平Fig.3 The levels of BNBD4 mRNA transcription in differenttissues of the Bos

2.5 原核表达重组质粒构建与鉴定将目的基因BNBD4 与pET-32a 载体连接，获得重组质粒pET32a-BNBD4，经EcoRⅠ和MluⅠ酶切鉴定结果显示，产生4 500 bp 和1 500 bp 的目的条带（图4）。测序分析结果显示重组质粒中正确插入BNBD4 序列。表明重组质粒pET32a-BNBD4 构建正确。

图4 重组质粒pET32a-BNBD4 酶切鉴定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pET32a-BNBD4 by enzyme digestion

2.6 牦牛BNBN4 的表达与western blot 鉴定将重组质粒转化E. coli BL21（DE3）感受态细胞，诱导12 h 后收集表达产物，进行SDS-PAGE 检测，出现大小约为23 ku 的重组蛋白，而阴性对照在相应位置未见明显条带（图5A）。目的蛋白存在于破碎后的沉淀中，表明该蛋白主要以包涵体形式表达。Western blot 鉴定结果显示明显的特异性蛋白印迹带（图5B）。表明正确表达了BNBD4 重组蛋白。

图5 重组蛋白BNBD4 的原核表达与鉴定Fig.5 Prokaryotic expression and identification of recombinant protein BNBD4

2.7 重组蛋白BNBD4的毒性试验重组蛋白BNBD4对大肠杆菌的毒性试验结果显示，5×107cfu/mL、5×106cfu/mL、5×105cfu/mL、5×104cfu/mL 浓度的重组菌菌落均明显少于对照组（图6），表明重组蛋白BNBD4 对大肠杆菌BL21（DE3）具有明显的抑制作用。

图6 重组蛋白BNBD4 对大肠杆菌的抑制作用Fig.6 Antibacterial effect of recombinant protein BNBD4 on E. coli

3 讨 论

牦牛BNBD4 基因编码区全长195 bp，可编码64个氨基酸，N 末端的23 个氨基酸是信号肽序列，含有明显的疏水区，更加容易与膜结合，有利于信号肽引导蛋白的运输[12]。绝大数β 防御素是阳离子型，BNBD4 成熟肽的阳离子易于与病原体带负电的磷脂膜结合，从而破坏细胞膜的完整性，与BNBD4的抑菌或杀菌功能相适应[13]。BNBD4 与其他牛源防御素类的二级结构组成基本一致，其中无规卷曲结构所占比例最高，有利于β 防御素的稳定性[14]。成熟的β 防御素蛋白多由38～42 个氨基酸组成，含有6个保守的半胱氨酸残基，形成3 个分子内二硫键[15]，本实验结果与之一致。本实验对牦牛BNBD4基因序列分析得知，牦牛BNBD4 与黄牛、水牛的相似性较高，与猪、人、鼠的相对较低，但同属中其保守性较高。动物种间β 防御素同源性差异较大，达尔文进化论中提到物种之间感染的病原不同，从而导致一些基因发生有益于自身的显著突变来抵御外界病原体，进而导致物种间同源性差异较大，β防御素动物种间同源性差异大符合该理论。

作为机体免疫第一防线的β 防御素广泛存在于动物体内。β 防御素4（BD4）在鲑鱼的粘膜组织、肌肉和性腺中分布较多，在其它组织中处于中等水平[16]。BNBD4 在黄牛的肺脏、脾脏、淋巴结、乳腺细胞以及周围血单核细胞中表达量相对较高，在肝脏、睾丸、子宫中表达量很低，在小肠中几乎未发现[17]。在水牛子宫内膜中未发现BNBD4 转录本[18]。但脂多糖LPS 可显著刺激奶牛子宫内膜上皮细胞BN⁃BD4 转录水平显著升高，提示β 防御素可能起到改善子宫内膜炎的作用[19]。杨宇琴等通过免疫组化法在健康牛的肠、支气管、肺泡和脾红髓等发现BN⁃BD4 的分布，其在肠中表达量最高，在肺中相对较低，且与健康肺组织相比，病变肺组织中的BNBD4表达量升高，推测BNBD4 在机体中可能发挥免疫作用[20]。BNBD4 在荷斯坦奶牛乳腺中同样有一定量的表达[21]。Brodowska 等发现BNBD4 基因中的两个单核苷酸多态性（SNPs）与牛奶生产和乳房健康等生产性能有关，推测其对于抵抗乳房炎症有重要作用[22]。本研究发现牦牛BNBD4 mRNA 在脾脏、肺脏、肝脏和肾脏等实质性器官均有分布，BNBD4 在脾脏和肺脏内转录水平也相对较高，从而推测BNBD4 在机体的免疫应答中发挥着一定的作用。

β 防御素家族在哺乳动物的先天性免疫和获得性免疫系统中起着重要的作用，在过去的研究中已表明β 防御素4 的体外表达产物也对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较强的抑制或杀伤作用[2,5,23]。纯化的重组人β 防御素4（HBD4）对铜绿假单胞菌有较强的杀菌活性，其效能高于哌拉西林和环丙沙星，具有烧伤创面感染治疗的应用前景[24]。重组mBNBD4 蛋白与无毒力的耻塘分枝杆菌和有毒力的牛分枝杆菌共培养后，通过致使牛分枝杆菌细胞壁发生破裂而死亡，且在高浓度该蛋白长时间作用情况下几乎可杀死全部的细菌，推测可能与防御素阳离子与细菌壁阴离子的相互作用有关[25]。通过基因工程方法表达的奶牛β 防御素4 具有抑菌作用，且对革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌的抑菌效果要好[5]。本研究中毒性试验结果也显示牦牛重组蛋白BNBD4 对大肠杆菌的生长具有抑制作用。这些都将为β 防御素4 在生产上的应用提供一定的理论依据，一方面可作为添加剂加到动物饲料中增强动物免疫力，尤其是对牦牛养殖起到指导作用。另一方面可作为治疗性抗菌药物开发的良好靶标。

综上所述，本研究首次获得并分析了牦牛BN⁃BD4 基因ORF 序列及其组织分布，并表达了重组牦牛BNBD4 蛋白，鉴定了其对大肠杆菌BL21（DE3）具有一定抑制作用，为进一步探究牦牛BNBD4 基因的功能提供了基础数据。