我国首次牛结节性皮肤病病毒的分离鉴定

张敏敏，孙亚杰，刘文兴，刘任强，王喜军，步志高*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069；2.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

牛结节性皮肤病（Lumpy skin disease，LSD）是由牛结节性皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus，LS⁃DV）引起牛的一种重要疫病，临床表现以发热、皮肤水肿及局部坚硬的结节或溃疡为主要特征。LSD可导致乳牛产奶量减少、公牛暂时或永久不育、皮张利用价值大大降低。发病率在2%～45%之间，致死率高达20%[1]，奶牛更为易感。节肢动物的机械性间接传播被认为是LSDV 传播的主要途径[1]。该病在跨境动物疫病中具有高影响力，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的疫病之一[2]。

LSDV 属于痘病毒科，与绵羊痘病毒和山羊痘病毒共同组成羊痘病毒属。LSDV 是双链DNA 病毒，全基因组约由156 个假定基因组成[3]。LSDV 和其它痘病毒一样，病毒基因组由中间核心区域以及两端的反向重复序列组成，且羊痘病毒属各成员之间基因组序列高度同源。血清学上很难将属内的各病毒成员加以区分，但通过感染动物的种属特性可以初步判断，同时必须结合多种诊断方法才能最终确定。羊睾丸（LT）细胞、牛肌肉细胞、MDBK 细胞及OA3.Ts 细胞对LSDV 较敏感[4-5]，可用于该病毒的分离。

本研究利用采自新疆伊犁地区临床疑似LSD 症状的牛病变皮肤样本接种LT 细胞，对产生细胞病变的培养物经透射电镜观察、间接免疫荧光检测、PCR 检测、基因序列分析，结果表明分离到引起我国首次LSD 疫情病毒株。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料病变皮肤组织（病料）无菌采集自新疆伊犁地区发病牛。LT 细胞由本实验制备冻存。细胞培养基为含10% FBS 和2%双抗的MEM（Hyclone，美国）。羊痘病毒阳性血清由本实验室制备。用于病毒分离的LT 细胞培养基含青链霉素浓度为10%（V/V）。病毒DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeSTAR®Max DNA Poly⁃merase 购自TaKaRa 公司；驴抗羊IgG-FITC 二抗购自SIGMA 公司。本研究涉及的活病毒相关操作均在哈尔滨兽医研究所高等级生物安全III 级实验室进行。

1.2 病毒分离与滴定将无菌采集的病牛病变皮肤组织样品研磨后用含10%双抗的PBS重悬，5 000 r/min离心10 min，取上清接种LT 细胞，37 ℃，5% CO2孵育1 h，弃上清，用PBS 洗3 遍，补加10% FBS 的MEM，继续培养至出现90%细胞病变（CPE）时，收获细胞培养物，将其反复冻融3 次，5 000 r/min 离心10 min，收取上清病毒液按10-1～10-7连续梯度稀释后，以每孔加100 μL 的量加入96 孔细胞培养板内，同时设立空白对照。接种后连续观察6 d，根据典型痘病毒细胞病变，按Reed-Muench 法计算病毒半数感染量（TCID50）。

1.3 分离病毒的鉴定

1.3.1 病毒粒子的形态学观察 将上述上清病毒样品进行浓缩，按常规的负染方法固定染色、制备样片，利用透射电子显微镜（日立H-7650）观察病毒粒子形态。

1.3.2 分离病毒株的间接免疫荧光试验（IFA） 将1.2 中收集的病毒液100 倍稀释后，接种长满24 孔板的单层LT 细胞，培养72 h 后用4%多聚甲醛固定20 min，以山羊痘病毒阳性血清（1:100）为一抗，驴抗山羊FITC-IgG（1:200）为二抗，进行IFA 检测。

1.3.3 分离病毒的PCR 检测与测序 根据LSDV TK基因两翼序列（AF409137.1），采用Oligo6.0 软件设计引 物: Forward primer（55844-55865）5'-TTGATGAAT ATAGCAACAAGCC-3'/Reverse primer（58275-58299）5'-AATGATCTCTTAAGTATTTAATATG-3'。引物由吉林库美生物科技有限公司合成。采用DNA 提取试剂盒提取1.2 中收集的病毒液总DNA，利用上述引物进行PCR 扩增，反应体系：PrimeSTAR®Max DNA Polymerase 10 μL；Forward primer 和Reverse primer 各1 μL（10 pmol）；模板2 μL；dH2O 6 μL，共20 μL。PCR 条件为：98 ℃10 s，55 ℃15 s，72 ℃10 min，30 个循环。 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳初步判断为阳性后，由吉林库美生物科技有限公司测序后进行分析。

1.3.4 分离病毒的全基因测序与系统进化分析 将提取的总DNA 基因组由北京诺禾致源科技股份有限公司进行二代测序（De novo），以Neethling LW 病毒株（AF409137.1）作为参考序列。测序完成后，用系统进化树分析（MEGA 7.0）软件，与数据库中已知的所有病毒株（LSDV）全基因组进行比对分析，并构建进化树。

1.3.5 分离病毒株的一步法生长曲线测定 将分离病毒以感染复数（MOI）0.1 接种长满6 孔板的单层LT细胞，每天收取细胞上清和等体积的的相应细胞裂解物，每个时间点设3 个重复孔，测定TCID50，确定分离病毒生长曲线。

2 结果与讨论

2.1 病毒分离及电镜观察结果将研磨病料匀浆后的离心上清接种LT 细胞进行病毒分离，用倒置显微镜逐日观察，第6 d 观察到细胞明显地皱缩、变圆，即出现CPE。待CPE 达到90%时收取细胞，测定第一代病毒滴度，结果显示可达到106.5TCID50/mL。有报道描述LSDV 对LT 细胞、牛肌肉细胞、MDBK细胞或者OA3.Ts 细胞比较敏感，可以用于LSDV 分离[4-5]。但不同LSDV 株对细胞的敏感度不同，有些LSDV 株在分离时需要盲传几代才能出现CPE，有些接种后几天到十几天才能观察到CPE。本研究中的病毒株在接种LT 细胞第一代就观察到了CPE。通过负染电镜观察，可见典型的砖型的痘病毒样粒子，直径为200 多纳米。LSDV 的大小一般在290 nm×240 nm[6]，本研究中观察到的病毒粒子大小基本与之相符（图1）。由于痘病毒在复制过程中会产生胞内成熟粒子（IV）和胞外病毒粒子（EV）[6]，所以要想观察到各种形态的病毒粒子需要样品中有大量病毒粒子，另外羊痘病毒在形态学上很难与正痘病毒区分，需采用其它方法进一步鉴定分离的病毒。

图1 分离病毒株的透射电镜观察Fig.1 Electronmicroscopy visualization of negatively stained LSDV

2.2 分离病毒株的IFA 结果由于LSD 于2019 年首次传入我国[7]，尚未有针对该病原的阳性血清，而羊痘病毒属中的各病毒成员之间同源性很高，血清学有很强的交叉反应[8]，所以本研究选择其它羊痘病毒的血清作为检测血清。将感染分离病毒72 h 后的LT 细胞经IFA 检测，结果显示，病毒感染细胞出现亮绿色荧光，而空白细胞无荧光（图2），表明该病毒株可能为LSDV。

图2 IFA 结果Fig.2 Result of indirect immunofluorescence assay

2.3 分离病毒株PCR 检测结果提取病毒液DNA，以LSDV 的TK 基因两翼序列为模板设计特异性引物进行扩增，结果PCR 扩增产物片段大小位于2 000 bp～3 000 bp，与预期LSDV 基因组相应序列片段大小一致（图略）。PCR 产物测序结果显示，该PCR 扩增片段与NCBI 中LSDV 相应片段的相似性为99.98%，进一步确定该分离株为LSDV，命名为LS⁃DV/China/Xinjiang/2019。本研究以LSDV 的TK 基因两翼序列为模板，设计特异性引物进行扩增，由于GTPV，SPPV 与LSDV 基因序列同源性很高，所以必须要结合测序结果来判断。

2.4 分离病毒株基因组序列分析将分离病毒株基因组DNA 进行全基因组二代测序，所得序列与NC⁃BI 中所有LSDV 的基因组序列进行序列比对和系统进化树分析（MEGA 7.0），结果显示该分离株与LSDV/Russia/Saratov/2017 序列相似性最高（99.42%）（图3）。LSDV/Russia/Saratov/2017 首次由俄罗斯分离，本次分离的病毒株与俄罗斯分离株一样，均能引起病牛发热和全身性结节等典型的临床症状[9-10]。

2.5 一步法生长曲线分离病毒株接种LT 细胞后，取各个时间点的LT 细胞以及细胞上清样品进行病毒效价滴定，结果显示该分离病毒株在96 h 病毒效价达到最高，为106.8TCID50/mL。接种后4 d～5 d 为病毒滴度的平台期（图4）。该结果与文献报道的山羊痘病毒复制速度较慢的特点相符[11]。

本研究通过对疑似LSD 病牛的皮肤组织样品进行病毒分离，对分离物进行电镜形态学观察、免疫荧光学检测、PCR 检测与基因组测序、病毒培养特性等系统分析结果表明，首次成功在我国分离到1株LSDV，命名为LSDV/China/Xinjiang/2019。同源比对和系统进化树分析显示，本研究分离株与俄罗斯发现的LSDV/Russia/Saratov/2017 株高度同源，后者能够引起典型皮肤结节等临床症状，分离样品采集地点距离哈萨克斯坦边境仅60 km[10,12]，这些信息可为疫情溯源提供了重要线索。结合流行病学情况[7]，我国新疆伊犁疫情最大可能为邻国传入，但以何种传播方式途径，有待进一步分析研究。LS⁃DV/China/Xinjiang/2019 的分离为我国LSD 防控研究和技术研发奠定了基础。

图3 系统进化树分析结果Fig.3 Phylogenetic tree analysis of LSDV nucleotide sequences

图4 一步法生长曲线Fig.4 One-step growth curveof the isolatedvirus