电针对佐剂性关节炎大鼠踝关节滑膜细胞胞浆内IκB 磷酸化的影响

祁 芳，李艳玲，艾 坤*，蔡 雄，李 鑫，刘 梨，杨茜芸

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208，2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种病因不明、发病率高、致残率高的慢性自身免疫性疾病[1]，治疗棘手。中医针灸治疗RA 历史悠久、疗效甚佳，因此，RA 的疾病发展机制以及针灸治疗RA的干预机制持续成为了医学界的研究热点。 现有的研究证实，人体内核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB） 炎性通路的激活在RA 的发生发展中有着至关重要的作用[2]。 本实验以NF-κB 信号通路为切入点，通过电针佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠模型，在证实电针抗炎作用的基础上，通过检测大鼠踝关节滑膜细胞胞浆内NF-κB 信号通路上游的前信号因子IκB 的磷酸化水平，进一步揭示电针可能的抗炎机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

由湖南中医药大学实验中心提供的SPF 级雄性SD 大鼠70 只，体质量（100±15） g，动物许可证号：SYXK(湘)2013-0005，在条件适宜的SPF 级实验室喂养1 周后，用电子秤测量每只大鼠体质量，根据测量结果进行体质量的分层(10 g 一分层)，挑选体质量为（130±15） g 的大鼠纳入实验，体质量偏轻或偏重者剔除，最终保留60 只体质量均匀的大鼠，然后将不同体质量层次的大鼠随机分至正常组、模型组、甲氨蝶呤组（MTX 组）和电针组，每组15 只。

1.2 主要试剂与仪器

矿物油(湖南惟世尔科技有限公司)；灭活结核杆菌(美国Difco 实验室)；异氟烷(上海佳行股份有限公司)；AIMS 型动物纹身仪(深圳Reward 公司)；RWD510 型小动物呼吸麻醉机(山东格莱特股份有限公司)；移液枪(杭州雷琪实验器材有限公司)；Hamilton 250 μL 型微量注射器(北京Bloning 有限公司)；足肿测量仪(MGO37140 UGO Basile)；bt701-1b 型电针治疗仪(苏州医疗用品厂制造)。

1.3 佐剂制备[2]

高温灭菌后的干燥研钵置于精密天平上准确称取结核杆菌15 mg；用移液枪精密吸取矿物油12 mL加入研钵中充分研磨，直至矿物油清亮无明显悬浮杂质；将研磨好的MT 悬浮液移入EP 管中，经震荡仪混合均匀后，稀释、分装，配备成浓度为1.25 mg/mL的MT 悬浮液（以上操作均在通风橱中进行）。

1.4 AA 大鼠模型制备[2]

用小动物呼吸麻醉机将大鼠浅麻醉完毕后，将大鼠取出并固定，以酒精棉擦拭大鼠尾根部，并在尾根部皮下注射0.1 mL 佐剂，出针、按压片刻，造模完成。

1.5 模型制备成功的标志[3]

正式实验开始前进行预备实验，相较于正常组大鼠而言，致炎大鼠从第3 天开始逐步出现炎性相关的症状，例如皮温升高、尾部破溃等；随着时间的推延，症状持续加重，第9～12 天，造模后的大鼠（模型组为甚）出现明显致炎症状：皮毛散乱、皮温升高、体质量减轻且尾部多处溃烂，足爪各关节有不同程度的肿胀，以上现象提示造模成功。

1.6 取穴与治疗方法

取穴定位方法：参照“十三五”国家规划统编教材《实验针灸学》大鼠标准穴位图谱定位及拟人对照法定位[4]。 足三里：位于小腿外侧，膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm；关元：从胸剑联合至耻骨联合上缘以松紧带平均分为13 等份（每一等分模拟大鼠同身寸一寸），关元为耻骨联合上缘3 寸；阿是穴：取关节周围肿胀严重部位。（1）电针组[5]：用剃毛器将电针组每只大鼠的关元、两侧足三里及其附近的毛发清理，从造模后的第1 天起在每日的上午9～11点进行治疗。 将大鼠固定后，以半寸毫针刺于两侧足三里、关元穴以及1 个阿是穴，深度3 mm 左右。 每只大鼠接两组电针：“足三里(左)+关元穴”“足三里(右)+阿是穴”为一组，设置疏密波，频率为20/50 Hz，缓慢调节电流，以针身轻颤为宜，每次治疗时间持续20 min，7 次/疗程，共治疗3 个疗程21 d；（2）MTX组：MTX 灌胃治疗，剂量为0.35 mg/kg，2 次/周，共给药3 周；（3）正常组与模型组不作干预。

1.7 观测指标及检测方法

1.7.1 体质量 大鼠分组后立即对所有大鼠进行编号，随后用电子称测量并记录每只大鼠的体质量作为基础数据，在造模后的第12、15、18、21 天的同一时间点以同样的方式对大鼠进行体质量检测和记录，整个实验过程中共记录5 次体质量的检测。

1.7.2 足爪容积的测量 大鼠分组后在其踝关节外侧进行纹身标记(该标记持续存在，无需重复打点)，随后检测初始的足爪容积，在此基础上，实验期间大鼠足爪容积的检测时间与体质量的测量时间一致，共记录5 次足爪容积的测量。

1.7.3 关节炎评分[6]该项指标的评价依赖对大鼠的耳部、尾部以及四肢各大、小关节进行仔细观察，本研究中大鼠从造模的第12 天起，出现肉眼可观察到的致炎反应，因此，评分操作亦自第12 天开始，并依次在造模后第15、18、21 天，对大鼠进行关节炎指数评分。 具体评分细则为：0 分，无关节红肿；1 分，小趾关节的红肿；2 分，足趾关节与小趾关节均有肿胀；3 分，踝关节以下的足趾关节及小趾关节肿胀；4 分，包括踝关节在内的全部足爪的肿胀。每只大鼠四肢均进行评分，将四肢分数累积，累积分数越高则提示炎症越严重。 最高分累计为16 分。

1.7.4 踝关节HE 染色及Western-Blot 检测 造模后第22 天结束实验并取材，将大鼠用10%的水合氯醛麻醉后沿膝关节处离断后爪，全部大鼠左侧踝关节用于HE 染色，右侧踝关节用于检测踝关节滑膜细胞胞浆中IκB 磷酸化水平及其重要相关蛋白NF-κB 的含量。（1）踝关节HE 染色检测：大鼠后爪浸泡、固定、脱钙、冲洗、脱水、透明、浸腊、包埋、冷却，再固定、切片、展片、捞片、烤片、染色、脱水、透明、封片观察。（2）小动物手术器械完整剥离关节滑膜组织行Western-blot 检测：第一步，进行蛋白提取；第二步，进行蛋白含量测定；第三步，进行Western-blot操作，包括电泳、转膜、经孵育/曝光和图片分析。

1.8 统计学分析

实验完成后所得数据均由SPSS 19.0 进行分析，计量资料以“±s”表示，并进行正态性与方差齐性分析，对非正态分布的数据以秩和检验分析，正态分布且方差齐性者用LSD 方法，正态分布但方差不齐者用多元方差分析方法。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

致炎的大鼠先后出现纳差、少动、情绪激惹、皮毛松散等现象，以模型组最明显。 数据统计分析结果：（1）体质量：造模后的第12、15、18、21 天分别对大鼠进行体质量的测量，与正常组比较，模型组体质量显著减轻（P＜0.01），电针组、MTX 组差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，电针组、MTX 组大鼠的体质量在以上时段的测量中均显著高于模型（P＜0.05）。 （2）足爪容积：对各组大鼠第12、15、18、21 天足爪容积测量数据的统计分析：与正常组比较，模型组存在明显肿胀（P＜0.01），电针组亦存在肿胀（P＜0.05）；与模型组比较，MTX 组大鼠足趾关节的肿胀显著减轻（P＜0.01），电针组肿胀程度亦有减轻（P＜0.05）。 （3）关节炎指数评分：自造模后的第12、15、18、21 天分别进行关节炎指数评分。数据分析显示：与正常组比较，模型组、电针组的关节炎评分均存在显著性差异（P＜0.01）；与模型组比较，电针组关节炎指数则明显低于模型组（P＜0.05）。 见图1。

2.2 各组大鼠关节病理检查结果

HE 染色结果显示，正常组大鼠踝关节结构完好，骨骼线清晰，关节间隙适中，滑膜生长正常；模型组大鼠踝关节结构有明显的改变，关节间隙明显狭窄，关节滑膜增生和骨质破坏严重；另一方面，与模型组比较，MTX 组与电针组大鼠的踝关节结构保留较为完整，受破坏程度较轻，而MTX 组的大鼠踝关节破坏情况较电针组轻。 见图2。

2.3 滑膜细胞胞浆内IκB、PIκB 及胞核内NF-κB含量比较

与正常组比较，模型组大鼠细胞胞浆内的IκB显著低于正常组（P＜0.01），磷酸化的IκB（P-IκB）以及胞核内NF-κB 则显著高于正常组（P＜0.01）；与模型组比较，电针组大鼠细胞胞浆内IκB 含量与模型组差异无统计学意义（P＞0.05），P-IκB 含量则低于模型组（P＜0.05），而胞核内NF-κB 亦低于模型组（P＜0.01）。 见图3-4。

图1 各组大鼠一般情况比较

图2 各组大鼠踝关节HE 染色病理切片结果比较（HE，×40）

图3 各组大鼠关节滑膜细胞胞浆内IκB、PIκB，胞核内NF-κB 比较

图4 各组IκB、PIκB、胞核内NF-κB、β-actin 电泳图

3 讨论

已有研究证实[7-8]，NF-κB 对RA 的发生和发展主要体现在：一方面某些炎症因子例如TNF-α 的存在，会刺激和启动NF-κB 进行强烈的炎性反应，促成多种细胞因子、趋化因子、黏附分子的过度表达，使炎症反应迅猛而广泛，关节滑膜细胞增生过度；且过度增生的滑膜组织亦将分泌多种炎性介质，反作用于NF-κB，使炎性反应更为强烈而形成正向循环，推动炎症的恶化发展，使滑膜增生进一步加重；另一方面是活化的NF-κB 通路对滑膜细胞的凋亡起重要的抑制作用。对滑膜细胞凋亡起抑制作用的凋亡抑制蛋白c-IAP1 和c-IAP2 在NF-κB 被激活后，也会相应升高表达水平，阻止滑膜细胞进行正常的凋亡程序，导致滑膜细胞拥有肿瘤细胞的繁殖特性。 在过度增生和凋亡抑制的双重作用下，滑膜组织最终入侵关节和骨组织，导致疼痛、关节变形、丧失劳动能力。

本实验研究选择电针大鼠足三里、关元和阿是穴，主要基于中医学对RA 的认识和研究[9]，中医学认为RA 属“痹症”，其病因包括“外因”和“内因”两个部分，“外因”指“湿邪、风寒、居住不良、劳役过度、起居不节等”，而“内因”分为“先天享赋不足”和“后天之气不足”两方面，历代医家对RA 的治疗均遵循了“扶正祛邪”的基本原则。 足三里为足阳明之脉的合土穴，可调理脾胃、补益气血生化之源、固护后天之本。关元穴为任脉与足三阴经交会穴，有培肾固本、补益精血、调理冲任、固护先天之本的功效；另外，通过刺激阿是穴可以疏通经络，刺激气血运行，充分发挥经络的治疗作用，达到缓解疼痛、改善症状的目的。 另外，从分子生物学角度也证实[10-11]：电针能够确切改善RA 病情的确和干预NF-κB 信号通路有关系，然而具体的干预环节的研究仍不够深入和具体，其作用机制仍需进一步研究和探讨。

相关文献资料表明[12]：细胞胞浆内的IκB 主要作用是抑制NF-κB 信号通路的激活，在正常情况下IκB 通常和NF-κB 蛋白结合成无活性的复活体，防止NF-κB 蛋白进入胞核内进行复制后激活该炎性通路。 另外，即便有部分NF-κB 蛋白进入胞核内，IκB在一定程度上亦能对该蛋白的活动起到抑制作用[13]。因此，一旦机体由于某种原因导致IκB 磷酸化，IκB蛋白将迅速被水解，从NF-κB 与IκB 复合体上脱落，解除了抑制的NF-κB 则迅速进入细胞核内，与相应的κB 位点结合，实现对相关基因的表达调控，从而启动一系列炎症相关反应。由此可见，NF-κB 信号通路能够被激活，与IκB 的磷酸化有着密切联系：P-IκB 在细胞胞浆内表达低者，胞核内NF-κB 表达量也低；而P-IκB 表达越高者，则胞核内NF-κB 的表达也相应高。 本实验研究结果亦证实了该理论。

本研究的结果表明，NF-κB 信号通路在模型组大鼠关节滑膜细胞内得到高度激活，而电针组以及MTX 组中大鼠踝关节滑膜细胞内该信号通路得到良性的调控，因其胞浆内的IκB 磷酸化水平均较模型组低，表明电针治疗对抑制IκB 的磷酸化有较为明显的作用，从一定程度上抑制了NF-κB 信号通路的活化，从而抑制关节滑膜的增生增殖，减轻炎症反应，遏制类RA 的发生发展。 综上，降低滑膜细胞胞浆内IκB 磷酸化水平，良性调控机体内NF-κB 这一炎症信号通路，是电针有效对抗炎症、治疗RA 疾病的机制之一。