重症肌无力血清相关抗体致病机制研究进展

王 培， 梁文昭综述， 徐忠信审校

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种由自身抗体介导的破坏神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)信号传递的自身免疫性疾病，以骨骼肌无力和易疲劳为主要临床表现[1，2]。研究发现抗AchR-Ab、MUSK-Ab等其他针对胞内、胞外抗原的抗体通过一系列不同的机制，参与了MG致病的过程。血清抗体对MG的临床诊断、治疗、管理及预后的评估都具有重要意义，本文对MG相关抗体的形态结构、致病机制、临床意义相关进展综述如下。

1 NMJ的结构及功能

NMJ是由运动神经末梢和肌纤维特化形成的突触结构，包括突触前膜、突触间隙、突触后膜。突触前膜轴浆内含充满乙酰胆碱分子(Ach)的突触小泡。突触后膜由肌细胞表面特殊分化的终板构成，分布着AchR、离子通道及与细胞骨架相关蛋白如rapsyn，utrophin和dystrophin等[3]。突触间隙内充满细胞外基质，内含可将乙酰胆碱水解为乙酸和胆碱的乙酰胆碱酯酶(AchE)。从神经纤维传来的信号通过NMJ以“电-化学-电信号”的模式传递给肌纤维。神经运动纤维产生电信号，使Ach出胞释放至突触间隙，并与突触后膜AchR结合，离子通道开放后肌膜去极化产生终板电位，诱发Ca2+从肌浆网释放，通过兴奋-收缩偶联机制使肌纤维收缩(见图1)。AchR以团簇的形式聚集在突触后膜肌纤维终板上，局部AchR密度增大可以增强信号传递[4]。其中Agrin-LRP4-MUSK信号通路诱导的AchR簇集是维持NMJ信号传导的关键因素，所有靶点的损伤都可能破坏NMJ的结构或功能，导致神经-肌肉传递障碍[1]。

MUSK、agrin、LRP4是构成NMJ必不可少的部分(见图1)。有研究提出神经肌肉接头形成的过程中，在运动神经元轴突分支到达、支配肌纤维之前，MUSK激活诱导肌纤维“预排”(pre-patterning)，在肌管中央有弥漫分布、不稳定的“初始”的AchR簇。Agrin稳定早期的AchR簇，锚定在基板上并与LRP4结合，诱导MUSK的二聚和自激活，进而诱导突触前和突触后的分化。运动神经支配后，MUSK的表达下调，并特定固定在突触后膜发挥作用。在神经肌肉接头发育成熟的过程中，NMJ增大、形态及分子组成改变，例如原始的AchR逐渐成熟(AchR的γ亚基由ε亚基替代)，突触后膜特化，成熟的AchR以簇集的形式聚集在肌纤维终板上实现传导[5，6]。还有很多蛋白及分子参与、调控该过程，如Rapsyn蛋白(receptor-associated protein of the synapse)作为一种自聚合的结构蛋白，通过微管微丝交联因子1 (microtubule actin cross-linking factor 1，MACF1)的介导，将AChRs与肌动蛋白(actin)细胞骨架锚定，形成成熟的簇固定到突触后膜终板。热休克蛋白分子伴侣Tid1s(tumorous imaginal discs1)和Rapsyn固定突触后膜AchR簇，Tid1s还促进 DOK7-MUSK信号通路(MUSK激活过程)。此外，Wnt-MUSK(CRD)、LRP4、肌肉源性的层粘连蛋白α4、α5和β2还可通过肌肉-神经逆行通路调节突触前膜的功能[7，8]。

2 MG相关抗体

MG是自身抗体介导的神经系统疾病，根据抗原定位，可将抗体分为抗胞外(跨膜)抗原的抗体和抗胞内抗原的抗体两大类。所有参与NMJ信号传递环节的抗体均可能影响疾病。胞外(跨膜)抗体包括AchR-Ab、MUSK-Ab、LRP4-Ab、agrin-Ab、ColQ-Ab、kv1.4-Ab，胞外(跨膜)抗体主要通过直接或间接影响神经肌肉接头AchR功能而致病。抗胞内抗原的抗体包括titin-Ab、RyR-Ab、Cortactin-Ab，目前暂无确切的胞内抗体致病的直接证据，但胞内抗体提示可能合并胸腺瘤、心脏受累、病情较重[1]，具体机制有待进一步研究。

2.1 抗乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab) AchR是NMJ突触后膜上的跨膜糖蛋白，AchR的5个亚基中间形成离子通道[9]。突触前膜合成并以量子的形式释放Ach，与突触后膜上的AchR结合，使离子通道开放钠离子内流、钾离子外流，肌膜去极化产生微小终板电位(mEPP)，mEPP逐渐累积产生EPP，当EPP峰值达到阈值时诱发肌纤维产生动作电位，引起肌纤维收缩[4]。

AchR-Ab主要致病机制现阶段认为主要有以下几方面：(1)补体激活；AChR-Ab与抗原结合激活补体，膜攻击复合物(MAC)的形成，最终导致细胞膜溶解、突触后结构被破坏如终板皱褶简化、AchR减少、突触内碎片等，并且动物实验发现补体激活是AchR-Ab病理机制的主要原因[5]。(2)抗原调节：AchR-Ab与AchR交联(crosslink)，加速突触后膜AchR内化和破坏，使突触后膜AchR减少。(3)部分抗体直接阻断Ach结合位点，破坏传导通路(见图1)[1，5]。AchR-Ab按照作用机制分为结合抗体、阻断抗体和调节抗体，相较另外两种抗体结合抗体有诊断价值[10，11]。

2.2 抗肌肉特异性酪氨酸激酶抗体(MUSK-Ab) MUSK是突触后膜表达的一种跨膜蛋白，MUSK细胞外区域包含三个Ig结构域(Ig1/2/3)和一个富含半胱氨酸的结构域(cysteine-rich domain，CRD)，胞质结构域包含酪氨酸激酶结构域、短的近膜区和由8个氨基酸构成的的羧基端序列[5，12]。MUSK Ig1结构域与LRP4结合，agrin从神经末梢释放后与LRP4结合，agrin与LRP4的结合也能促进MUSK-LRP4作用。Agrin-LPR4复合物与MUSK的相互作用引发了MUSK的磷酸化和活化，激活的MUSK促进突触后膜AchRs的簇集、维持突触后膜的结构及功能[1，3]。为了维持MUSK的活化和刺激下游通路，DOK7作为肌肉细胞内的衔接蛋白，与MUSK的胞内结构域作用。除agrin-LRP4-MUSK-DOK7信号通路促进MUSK激活、AchR簇集外，Wnt-MUSK(CRD)在NMJ早期神经支配前也促进AchR聚集，即AchR的“预排”(prepatterning)[7，8]。此外MUSK还可通过AchE-ColQ复合物实现AchE在突触后膜的锚定(见ColQ部分)。

MUSK-Ab主要是IgG4型，与AchR-Ab作用机制不同(两种抗体Fc域不同)，目前研究认为，MUSK-Ab不直接激活补体也不参与抗原调节，而是通过作用于MUSK与LRP4、ColQ等蛋白的结合位点(MUSKIg1、CRD结构域)，抑制了 MUSK激活，阻断agrin-LRP4-MUSK信号传递，使突触后膜AchRs密度减低，NMJ处传导减少致骨骼肌无力和易疲劳[1，7]。还有一小部分抗体是IgG1-3型，MUSK-Ab IgG1-3也能减少C2C12肌管中AchR的簇集，但并不阻断LRP4-MUSK间相互作用[5，13]。也有研究显示，MUSK-Ab通过阻止MUSK与ColQ结合，导致AchE催化活性降低，是另一个可能的致病机制，并认为这也可能是MUSK-MG对ACEI类药物抵抗的原因[7]。MUSK-MG病情普遍较重，且与抗体滴度相关[1]。

2.3 抗低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体(LRP4-Ab) LRP4是一种跨膜蛋白，其胞外结构域较大包含9个低密度脂蛋白(LDL)的结构域、2个表皮生长因子(EGF)样结构域和4个β-螺旋结构域。胞内结构域较小，包括1个NPXY模序和与PDZ相作用的C端。LRP4第1个β-螺旋结构域与agrin结合，第3个β-螺旋结构域与MUSK第1个Ig结构域结合，第3个β-螺旋结构域的边缘部分调节MUSK信号以及中心部分调节Wnt信号[3，5，8，14]。LRP4与agrin、MUSK形成六分子复合物在神经肌肉接头传递信号[3]。

LRP4-Ab参与MG的可能机制现阶段研究主要考虑以下几个方面：(1)LRP4-Ab通过直接与位点相作用或者间接作用于远端位点改变细胞外的结构域，进而干扰MUSK-LRP4、agrin-LRP4的相互作用。有研究发现LRP4-MG患者血清破坏了LRP4-agrin作用[15]。(2)LRP4-Ab也可能通过交联，诱导LRP4内化，细胞表面的LRP4减少。(3)LRP4-Ab也可能通过补体激活损伤NMJ，目前已经在动物实验中得到验证[3]。

2.4 抗集聚蛋白抗体(Agrin-Ab) Agrin是一种由运动神经末梢释放的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)。agrin N端包含9个卵泡抑素样的重复序列，中心包含两个层粘连蛋白B样结构域，C端包含3个层粘连蛋白G样(LG)结构域、4个EGF样结构域。N端结构对agrin固定在NMJ是必需的，其C端(LG3结构域)的B/Z剪接位点中插入8个氨基酸形成的B/Z结构区(即Z8)与LRP4构成二聚体，这对突触后膜AchR的聚集起重要作用[1，3，5，16]。agrin 与肌纤维膜上的蛋白结合(如LRP4、肌营养不良蛋白聚糖、层粘连蛋白)，调节NMJ的形成、维持和再生[1]。Agrin与LRP4结合是NMJ中agrin-LRP4-MUSK信号传递通路的重要环节，同时agrin还能促进MUSK与LRP4间的相互作用[3]。

动物模型主动免疫agrin致病已得到证实，有研究发现MG患者血清能抑制C2C12肌管中agrin介导的MUSK磷酸化，提示LRP4-agrin间相互作用受阻。Agrin-Ab作用机制考虑为agrin-Ab阻止agrin与LRP4结合，NMJ信号传递受损，抑制MUSK磷酸化和AchR的簇集[1，5]。

2.5 抗ColQ抗体(ColQ-Ab) 胶原蛋白(Collagen)构成细胞外基质的骨架，是突触间隙中突触基底结构的组成成分。ColQ是AchE瞄定和聚集在NMJ环节中至关重要的蛋白，ColQ瞄定、结合细胞外基质的AchE，并被固定在突触基底膜上。ColQ的每一条链都能与AchE的四聚体结合，NMJ中主要是A12型，由12个AchE亚基和3个ColQ组成[17]。ColQ的N端包含8个脯氨酸(PRAD)，N端结构域通过催化亚基与AchE相作用，中央胶原结构域的两个肝素结合位点介导与perlecan蛋白(一种HSPG)结合，perlecan结合α-dystroglycan，将细胞外基质和细胞骨架相连，C端与MUSK的Ig1和CRD结构域结合，ColQ和MuSK之间的关联使ColQ-AChE符合突触定位[8，17，18]。有关ColQ-Ab的病理机制的研究比较有限，ColQ-Ab可能破坏ColQ-AchE复合物浓度，减少突触间隙AchE的数量[19，20]。有研究发现ColQ功能受损导致Ach在突触间隙时间延长，终板电流的时间延长、离子流增强，最终导致终板肌病、神经肌肉传导受损、终板受体敏感性减低[17，19，21]。实验小鼠缺少ColQ后AChE不再分泌，突触间隙Ach呈高水平状态。Sigoillot等发现骨骼肌、肌管ColQ敲除的小鼠，膜结合MUSK和AchR簇集均减少，在ColQ缺乏的肌管中补充ColQ后能部分恢复agrin介导下的AchR簇集[17，22]。但是Otsuka等研究发现，AchE-ColQ复合物能阻滞MUSK与LRP4相互作用，抑制agrin-LRP4-MUSK信号通路。因此ColQ对AchR聚集可能存在两个相反的作用机制[23]。

2.6 抗kv1.4抗体(kv1.4-Ab) 电压门控式钾离子通道是由四个跨膜α-亚基构成的四聚体，kv1.4是分子量大小约为73 KDa的α-亚基，kv1.4控制突触前膜Ach的释放[4，24]。Kv1.4主要在中枢神经系统神经元中表达，也存在于外周神经、骨骼肌和心肌中[24]。

有研究发现，Kv1.4-Ab在日本MG患者阳性率为11%～18%，症状重，可以合并心肌炎、肌无力危象、胸腺瘤等。而Kv1.4-Ab在高加索人MG患者中阳性率接近(为17%)，但这些患者症状相对较轻，多数仅表现为眼肌型[4，25]。这可能与不同种族间遗传差异相关，例如在高加索人群中DR3与EOMG(发病年龄小于50岁)正相关，与LOMG(发病年龄大于50岁)负相关；DR7反之。而DR3与DR7在日本MG患者中罕见，取而代之的是DR9与DR2，与高加索人群中DR3和DR7有类似的关系[25，26]。

2.7 抗连接素抗体(Titin-Ab) Titin是一种位于骨骼肌和心肌肌小节内的丝状肌肉蛋白，大小约3000-4200kDA，是分子量最大的肌肉蛋白。但titin-Ab特异性作用于titin 30kDA区域，约占titin大小的1%(即MGT30)，MGT30靠近肌小节 A/I带交界处，是titin主要的免疫原区[4，27，28]。Titin对骨骼肌收缩起着关键作用，titin-Ab可能是通过表位扩展与胞内抗原反应，影响肌肉收缩。在EOMG患者中titin-Ab对提示胸腺瘤的意义较大[27～29]。

2.8 抗兰尼碱受体抗体(RyR-Ab) 兰尼碱受体(RyR)是骨骼肌和心肌肌浆网上的Ca2+通道，RyR的四种同源性亚基中间形成一通道。RyR通过介导Ca2+从肌膜释放到细胞质参与兴奋-收缩耦联机制，肌膜去极化时通道开放，Ca2+从肌膜进入细胞质，激活肌浆中的收缩蛋白、引起肌肉收缩[30，31]。RyR有两种分型，其中RyR1型与骨骼肌相关，心肌为RyR2型，RyR-Ab能与两种分型交叉反应[32]。关于RyR-Ab病理机制目前认为RyR-Ab作用于RyR，阻止兰尼碱(Ryanodine)和RyR的结合，离子通道开放受阻，Ca2+释放受限[33]。研究发现RyR-Ab可引起RyR功能变构抑制。通过动物实验发现RyR-Ab在体内直接与RyR结合是肌无力的致病因素[34]。

2.9 抗皮质蛋白抗体(Cortactin-Ab) 皮质蛋白(Cortactin)是一种骨骼肌的胞内微丝肌动蛋白结合蛋白，在NMJ中促进肌动蛋白(actin)的组装和MUSK介导下的AchR簇集。Cortactin和Arp2/3蛋白复合物均在AchR簇位点富集，cortactin是酪氨酸激酶的底物，Arp2/3蛋白复合物是皮动蛋白的重要靶点，也是细胞内actin聚合的关键调节因子[35]。目前认为agrin/MUSK信号通过src(可能还有其他)酪氨酸激酶作用于cortactin，cortactin与Arp2/3复合物(可能还有Nck1、N-WASP等蛋白)共同作用，促进actin在NMJ的聚合和AchR的簇集[8，35]。研究发现酪氨酸磷酸化缺陷的cortactin突变体强制表达后，会抑制agrin诱导的AchRs簇集，通过RNA干扰降低内源性cortactin水平也是如此[35]。

Illa等提出cortactin-Ab的免疫原理可能与抗双载蛋白抗体(stiff person encephalomyelitis)假说类似，在神经肌肉传递过程中，胞内抗原在突触间隙表面“短暂的兼职”(transient moonlighting)，给自身抗体一个短暂的机会窗口，抗原-抗体可以瞬时特异性结合作用[36，37]。Cortactin-Ab在健康人群和其他疾病中均有发现，如Lambert-Eaton肌无力综合征，这意味着cortactin可能也在突触前表达，并作为Wnt信号依赖的突触前效应分子[8]。Cortactin-Ab可能对血清双阴性的眼肌型MG患者有着重要诊断价值[36]。

NMJ由突触前膜、突触间隙、突触后膜组成，Ca2+内流诱发Ach出胞从神经末梢释放至突触间隙，与突触后膜AchR结合，离子通道开放，肌肉收缩(图中黑色箭头所示)。Agrin从神经末梢释放，在NMJ形成agrin-LRP4-MUSK信号通路，在Rapsyn蛋白等作用下促使突触后膜AchR簇集(蓝色箭头及对话框所示)。AchR-Ab激活补体，形成MAC破坏突触后膜；AchR-Ab与突触后膜AchR交联，加快AchR内化及退化；AchR-Ab也可以直接阻断Ach结合位点(图中红色对话框标注)。MUSK-Ab、LRP4-Ab、agrin-Ab作用于agrin-LRP4-MUSK信号通路影响突触后膜AchR簇集和NMJ。Titin-Ab、RyR-Ab影响肌肉收缩。Cortactin-Ab可能与抗原瞬时结合，抑制突触后膜AchR聚集。ColQ-Ab可能破坏ColQ-AchE复合物，影响突触间隙AchE数量。

3 结 论

综上，重症肌无力是累及NMJ的自身免疫性疾病，血清抗体检测是诊断MG的主要方式。AchR-Ab、MUSK-Ab是MG主要致病抗体且致病机制已较为明确，其余抗体的机制有待进一步研究。对于LRP4-Ab、agrin-Ab，已有研究发现实验动物主动免疫抗原后产生抗体，并与自身抗原反应表现出MG样症状，但还需被动转移患者血清(抗体)至实验动物观察是否出现肌无力症状来进一步证实抗体致病[5]。RyR、titin、cortactin是肌肉收缩的重要蛋白，但其细胞内定位使得自身抗体不太可能在MG中发挥直接致病的作用[4]。除上述抗体外，在MG患者血清中还发现有Collagen XIII-Ab、Rapsyn-Ab、AchE-Ab等抗体，但机制不清楚。此外仍有5%～10%的患者血清中未能检测出已知的抗体(血清抗体阴性)[5]。MG是由免疫等多种因素参与的疾病，血清抗体为MG的诊断、疗效、预后等方面提供依据，而MG的相关血清抗体机制的进一步研究有利于MG患者的早期诊断及精准治疗。