200株血流感染大肠埃希菌耐药性分析

刘存芬， 王 燕， 杨 溶， 胡丽香

（安宁市人民医院检验科，云南 安宁 650300）

近年来，血流感染的发生率呈现出逐年上升的趋势，血流感染病原菌的构成发生了显著的变化，且病原菌的耐药性也逐渐提高[1]。了解和掌握病原菌的构成情况，对于临床治疗有重要的作用[2]。大肠埃希菌是血流感染最常见的病原菌，其主要耐药机制是产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBL）和携带整合子[3]。本研究对安宁地区大肠埃希菌的耐药性及ESBL基因型与整合子的关系进行分析，以期掌握大肠埃希菌耐药特点及流行趋势，为治疗和控制产ESBL大肠埃希菌感染提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集分离自2018年6月—2019年3月安宁地区医共体医院血流感染住院患者血液样本的200株大肠埃希菌，患者男121例、女79例。质控菌株大肠埃希菌（ATCC 725922）和肺炎克雷伯菌（ATCC 700603，产SHV-12型），购自。

1.2 主要仪器与试剂

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪（德国Eppendorf公司），PCR试剂、DNA标志物（北京生物有限公司），VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪及配套鉴定卡（法国生物梅里埃公司）。

1.3 细菌鉴定与体外药物敏感性试验

采用VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪及配套鉴定卡分析菌株对氨曲南、阿米卡星、头孢曲松、头孢呋辛、头孢他啶、亚胺培南、庆大霉素、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑、氨苄西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦的耐药性。依照美国临床实验室标准化协会2019年标准进行结果判读。采用VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪对产ESBL菌株进行筛选，并采用双纸片法进行确认[4]。

1.4 ESBL基因分型检测

采用煮沸法提取大肠埃希菌及接合子菌株基因组中的DNA，参考文献[5]建立PCR反应体系，扩增相关耐药基因，产物纯化后送生工生物工程（上海）有限公司进行测序，引物序列见表1。采用多重PCR检测SHV，严格按照仪器与试剂说明书要求进行操作。

表1 引物序列

1.5 统计学方法

采用WHONET 5.4软件进行统计分析。计数资料以率表示。

2 结果

2.1 体外药物敏感性试验结果

200株大肠埃希菌中有118株（59.00%）产ESBL。大肠埃希菌对氨苄西林-舒巴坦的耐药率最高（83.23%），对亚胺培南的敏感率最高 （97.42%）。见表2。

表2 大肠埃希菌体外药物敏感性试验结果

2.2 产ESBL大肠埃希菌基因型分布

118株产ESBL菌株中，有105株（88.98%）扩增到ESBL基因，其中11株同时检出2种ESBLs基因型，3株同时检出3种ESBL基因型。所有基因型别中，CTX-M型所占比例最高，其次是TEM和SHE。见表3。

表3 产ESBL大肠埃希菌基因型分布

2.3 ESBL基因分型与Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类整合子的阳性率

在不同基因型大肠埃希菌中，仅检出Ⅰ类整合子，未检出Ⅱ类、Ⅲ类整合子。CTX-M-1型携带Ⅰ类整合子菌株所占比例最高（72.41%），SHV型携带Ⅰ类整合子菌株所占比例最低（50.00%）。见表4。

表4 ESBL基因分型与Ⅰ类整合子的阳性率

3 讨论

伴随着抗菌药物应用范围的日益广泛，血流感染在医院感染中的发生率逐渐增高。大肠埃希菌导致的感染是临床中较为常见的革兰阴性菌感染，也是导致血流感染患者死亡的主要原因。产ESBL是革兰阴性菌抵抗β-内酰胺酶类抗菌药物的主要机制。整合子与细菌多重耐药和耐药基因播散有密切的关系。陈艳华等[6]发现肿瘤患者中大肠埃希菌的基因型主要以TEM、CTX-M-13、CTX-M-1为主。张珍丹等[7]发现尿路感染患者耐药现象较为严重，大肠埃希菌基因型主要以TEM、CTX-M为主。

本研究分析了200株分离自血流感染患者的大肠埃希菌，发现ESBL阳性菌株占59.00%，大肠埃希菌对氨苄西林-舒巴坦的耐药率最高（83.23%），对左氧氟沙星的中介率最高（17.14%），对亚培安南的敏感率最高（97.42%）。近年来，产ESBL大肠埃希菌呈现逐年增加的趋势，这主要是ESBL会通过结合、转化等形式促使耐药基因在细菌间扩散导致的。对于血流感染患者而言，感染的途径比较多，主要有局部感染灶以及肠道黏膜屏障功能损伤等。同时，由于血流感染患者免疫功能较弱，在大量使用广谱抗菌药物的过程中，肠道内敏感菌被杀灭，大肠埃希菌等过度滋生，进而导致肠道内菌群失调[8]。大肠埃希菌的产生对患者的预后有重要的影响，本研究发现，大肠埃希菌的耐药性比较强，且对多种药物均有耐药性，但对亚胺培南较敏感。亚胺培南是一种碳青霉烯类抗菌药物，具有抗菌谱广、杀菌活性强的特点，被广泛应用于临床治疗中，是临床治疗革兰阴性菌感染的最佳药物，被誉为针对多重耐药革兰阴性菌感染的最后一道防线。

不同地区ESBL型别有很大的差异，依据同源性可将其分为TEM、SHE以及CTX-M多种型别，目前最流行的基因型是TEM和SHE型，我国的流行基因型是CTX-M型。本研究结果表明，118株产ESBL菌株中，有105株扩增到ESBL基因型，占88.98%，其中CTX-M型菌株的阳性检出率最高（72.41%），其次是TEM型，提示安宁地区大肠埃希菌存在多种基因型，但主要以单基因型为主。

整合子是一类可移动的基因元件，其在细菌耐药的基因水平传播方面占有重要的地位[9]。本研究仅检出Ⅰ类整合子，其中CTX-M-1型携带Ⅰ类整合子检出率最高，其次是CTX-M型和SHV-11型，SHV型携带Ⅰ类整合子的检出率最低，与AL-AGAMY等[10]的研究结果一致。

总之，携带整合子和产ESBL是大肠埃希菌主要的耐药机制。安宁地区大肠埃希菌ESBL阳性率比较高，基因型主要以CXT-M基因为主，且主要以携带Ⅰ类整合子为主。本研究结果有助于指导临床合理使用抗感染药物，减少ESBL在细菌间的播散，对感染性疾病的控制具有一定的价值。