2015—2019年上海等地区质谱细菌鉴定室间质量评价结果分析

张敏敏， 王敬华， 葛 平， 王庆忠， 徐 蓉， 刘学杰， 崔 琳， 钱诚凯， 夏启航， 陈 蓉

（上海市临床检验中心，上海 200126）

近年来，基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术被广泛应用于临床常见致病微生物的鉴定工作中，与传统病原微生物鉴定方法相比，MALDI-TOF MS技术具有操作简单、检测快速、特异性高、稳定性好、准确率高、耗能低等优点。MALDI-TOF MS可通过对病原微生物蛋白指纹图谱进行同源性分析及时确定致病微生物种属，对疾病诊断具有重要意义，有望成为临床微生物实验室检测工作的重要组成部分[1-2]。

上海市临床检验中心（Shanghai Center for Clinical Laboratory，SCCL）是上海市临床检验质量控制组织评价机构，2015年开始开展质谱细菌鉴定室间质量评价（简称室间质评）活动。本研究旨在通过分析2015—2019年质谱细菌鉴定室间质评活动反馈结果，了解上海市及部分其他地区临床实验室（包括独立实验室）微生物质谱检测开展情况及检测质量。

1 材料和方法

1.1 室间质评样本制备

将脱脂牛奶110 ℃条件下15 min高压蒸汽灭菌，冷却后分装0.3 mL到无菌冻存管中备用。选取美国标准菌种库（American type culture collection，ATCC）菌株，将其保存到脱脂牛奶保存管内，置-80 ℃冰箱冷冻，制备成冻干品，低温保存。

1.2 方法

1.2.1 室间质评方案设计 对参加SCCL质谱细菌鉴定室间质评活动的临床实验室发放室间质评样本。每年进行2次室间质评活动，每次发放5份样本。要求参评实验室根据临床标本来源选择相应的培养基，有临床意义的病原菌菌株采用质谱技术进行鉴定，并在规定日期内（样本接收后10 d内）将检测结果上报至SCCL数据库，超过规定时间系统将不再接收数据。

1.2.2 结果评价 依据回报的检测结果与预期结果的符合性统计各实验室的得分。合格判定原则：菌株正确鉴定到种水平得20分；正确鉴定到属水平，而种水平错误，得10分。总成绩≥80分为合格。对成绩进行汇总，并对错误的检测结果进行统计分析。

1.3 统计学方法

采用EXCEL 2007软件进行数据分析。计数资料以例或率表示。

2 结果

2.1 实验室回报情况

2015—2019年SCCL质谱细菌鉴定室间质评活动共发放样本50份，菌株涉及27个属43个种。参评实验室检测系统见表1。

表1 参评实验室检测系统 家

2.2 实验室检测能力评价

2015年参加SCCL质谱细菌鉴定室间质评活动的临床实验室有10家，2019年增加到40家，增加了300%。2015—2019年SCCL共开展10次微生物室间质评活动，合格率均为100%。其中，2015年第1次室间质评有4家实验室、2017年第1次和第2次室间质评各有1家实验室、2018年第2次和2019年第2次室间质评各有3家实验室未获得满分，其余均获得满分。发放的50株菌株中，有45株鉴定结果符合率为100%，鉴定结果有误的菌株有维罗纳气单胞菌、温和气单胞菌、中间葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌，符合率分别为60%、94.4%、95.5%、89.7%、92.5%。见表2、表3。

表2 2015—2019年SCCL质谱细菌鉴定室间质评成绩

表3 鉴定结果有误的菌株

3 讨论

MALDI-TOF MS技术主要用于临床各种送检标本分离培养后单菌落的检测，目前已被广泛用于分析血清/血浆、唾液和尿液标本，以诊断疾病、识别健康状况的潜在生物标志物，为临床实验室检测提供了一个简单方便的诊断模型[3-5]。MALDI-TOF MS技术在临床实验室中的应用不断被拓展，在微生物鉴定和特殊耐药微生物同源性分析方面具有一定的前景，也是研究和分析蛋白质的有力工具[6]。

SCCL通过开展质谱细菌鉴定室间质评活动，对上海和部分其他地区医疗机构微生物质谱鉴定能力进行了评价。（1）参评实验室由2015年的10家增加到2019年的40家，增加了300%，提示该检测方法正逐步被医疗机构接受，并运用到临床致病菌的鉴定中。可能是考虑到仪器价格比较昂贵，目前主要是三级综合性医院在使用；从鉴定系统的分布看，虽然绝大多数医疗机构使用的是进口质谱仪，但是国产质谱仪也开始逐步被医疗机构选用。（2）5年室间质评的合格率均达到100%，表明该项目整体检测质量较好。2015年第1次室间质评有4家实验室、2017年第1次和第2次室间质评各有1家实验室、2018年第2次和2019年第2次室间质评各有3家实验室未获得满分，其余均获得满分。发放的50株菌株中，有45株鉴定结果符合率为100%，但气单胞菌属、葡萄球菌属和链球菌属的鉴定结果各参评实验室略有偏差，提示个别实验室的检测能力有待进一步提高。

实验室回报结果发生错误的原因可能有培养时间、培养基、前处理方法、人员操作、仪器设备的选择和校正等多方面的因素。细菌的培养时间是一个非常重要的变量，不同生理条件下的细菌，如处于休眠、细胞分裂、老化等状态的细菌，其质谱图会发生变化。因此，在对细菌进行检测时，使细菌处于一个稳定的状态是十分必要的。在对细菌进行培养时，使用不同培养基对细菌进行鉴别具有重要意义，选择性培养基可以很容易地识别出致病菌，有效分离纯化致病菌。不同的实验室采用不同的标本处理方法，获得的结果也不完全相同，因此检测细菌时，可以将未经处理的标本直接进样，但缺点是将会产生较少的质谱峰。对于较干燥、细胞壁较厚的菌落，破壁效果会不理想，核蛋白不能完全被释放出来。为了获得较多的生物标志物，提高细菌检测的准确率，建议在检测前对标本进行处理，尤其是革兰染色阳性菌的检测。要规范操作流程、建立简便而重复性良好的检测方法，如靶板涂抹要均匀，过薄或过厚都不能形成较好的结晶。每次进行检测前都应使用标准品校准仪器。疑难菌株缺乏特异性峰值或峰值数量不足，无法形成图谱录入数据库，因此数据库还需要不断完善。

质谱细菌鉴定室间质评是保证各临床实验室检测质量的重要手段，可以考察参评实验室对临床微生物项目的检测水平，可以反映在检测中存在的共性问题，及某些实验室存在的特殊问题，促进实验室检测水平的提高，从而更好地服务临床。相信随着标本处理方法的不断优化，标准质谱图库的不断扩充、室内质量控制的不断加强、微生物检测实践经验和理论知识的不断丰富、相关管理制度的不断落实，临床实验室微生物质谱检测质量会越来越高。