NTPHGPX基因过表达和敲除对烟草苗期耐盐性的影响

郭鹏诚 杨晓 毛辉 王学波 申展 刘旦 杨爱国 王元英

摘要：为研究NIPHGPX基因对烟草耐盐性的影响，通过转基因技术获得VIPHGPR基因过表达和CRISPR/Cast9敲除材料，利用150mmol/LNACI对转基因材料处理14d，研究盐处理下转基因材料根长、GPx酶活性、丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）含量的变化。结果表明，NIPHGPX基因表达在盐胁迫3h后即受到诱导;盐处理显著抑制了野生型烟草根部的生长，提高了丙二醛和过氧化氢的积累;盐胁迫下过表达株系的根长比野生型更长，MDA和HO2含量较低，而基因敲除材料根的生长则进一步受到抑制，GPx酶活性明显降低，地上部MDA和H2O2的积累显著高于野生型。综上所述，过表达NIPEGPX基因提高了烟草的耐盐性，而敲除NIPHGPX3基因则减弱了烟草的耐盐性，推测NIPHGPX基因可能通过影响烟草体内活性氧物质的清除活性参与植株对盐害的胁迫响应。

关键词：磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶;耐盐性;基因功能;烟草

盐害是影响植物生长发育和产量的重要非生物胁迫叫，寻找植物耐盐基因能够帮我们了解植物耐盐机理，为耐盐种质资源的发掘提供参考，也为培育优质耐盐品种或改良优良品种的耐盐性提供依据。盐胁迫可以改变土壤渗透势导致植物吸水困难，过量的盐离子还会对植物产生离子毒害，使植物无法维持体内离子平衡2。盐胁迫对细胞膜破坏巨大，高浓度的Na*和C会影响植物对Ca2+的吸收，细胞膜上的Ca2被Na取代，使细胞膜的选择透过性变差，营养物质外泄，膜脂过氧化程度提高，有害物质积累，植物生长发育受损。盐胁迫使烤烟叶片叶绿体和线粒体严重受损，细胞核液浓度下降，核内异染色质化明显，影响烤烟品质，与盐胁迫类似的干旱胁迫造成烤烟叶片活性氧含量增加，叶绿体受到破坏，光合速率降低，植物生长发育受到抑制。

除渗透胁迫外，盐害还会造成活性氧物质（ROS）在体内的积累，对植物产生氧化胁迫。低浓度的ROS作为信号分子调控胁迫相关基因的表达，但高浓度的ROS会破坏细胞结构。植物受到氧化胁迫后迅速积累多种抗氧化酶来清除ROS，包括谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶SOD）、过氧化氢酶（CA）、谷胱甘肽还原酶（GR）及抗坏血酸过氧化物酶（APX）等01。茄科植物中GPx研究较少，DEPEGE等发现机摩擦能诱导番茄GPx的表达，并参与ROS的清除，而ALEIARBY等发现盐处理抑制了番茄中GPx的mRNA水平。

相比其他GPx家族成员，PHGPX能特异性清除膜上的磷脂氢过氧化物，对于维持细胞膜的稳态具有重要意义1611。杨晓东等对萝卜磷脂氢谷甘肽过氧化物酶基因（RSPHGPX）进行研究，发现其上游调控序列含有多个响应激素、胁迫、光信号的元件，RNA印迹分析发现RSPHGPX受到脱落酸、连续光照和冷胁迫的调控。刘赛等2克隆了茶树中的CSGPXL基因，其具有PEGPX特有的结构域，过表达CSGPX1使烟草抗旱性得到提升。HERBETTE等2在番茄中过表达家鼠的GPx5基因类似于植物中的PHGPX）发现转基因番茄更能抵抗机械损伤的影响，但易受到生物胁迫。CHEN等2在烟草叶片中瞬时表达番茄LEPHGPX，发现LEPHGPX可保护烟草叶片免于氧化胁迫和凋亡因子Bax引起的细胞凋亡。

目前有关烟草NTPHGPX的基因功能还鲜有报道。本研究发现在盐处理下NTPHGPR的表达急剧上升，推测NTPHIGPX能够参与烟草抵御盐胁迫的过程，进一步将该基因从烟草中克隆，利用基因过表达及敲除株系研究其在烟草抵抗盐胁迫响应中的作用，为解析NTPHGPX参与烟草响应盐胁迫的分子机制提供科学数据。

1材料与方法

1.1供试材料和处理

试验于2020年在山东青岛中国农业科学院烟草研究所进行，试验材料为烟草品种净叶黄，由中国烟草种质资源库提供。为了研究NTPEGPX是否受到盐胁迫的诱导，将烟草种子播于营养土，待苗长至4片真叶时，洗去根部杂土，置于150mmol/LNaC溶液处理0、1、3、6、12和24h，取幼苗真叶的最上部完全展开叶用于分析NTPHGPX基因在盐胁迫下的表达模式，每个处理取3次重复，每个重复取3棵烟株混样，液氮研磨提取RNA。正常条件下生长至4片真叶时，分别取烟草根、茎、叶等部位的组织，每个处理取3次重复，每个重复取3棵烟株混样，液氮研磨提取RNA，用于分析NTPHGPR基因表达的组织特异性。烟草植株在25℃、光周期为16h光照8h黑暗的培养室中进行培养。

为了研究转基因材料耐盐性是否发生改变，将烟草种子经消毒后播于MS培养基，琼脂浓度08%，发芽后选取生长一致的幼苗分为两组，一组移至MS培养基中，另一组移至含有150mmo/LNACI的MS培养基，生长14d后测量根长，每个处理4次重复，取地上部分用于测定GPx酶活性、MDA和H2O2含量等生理生化指标，每个处理3次重复。

1.2NTPEGPX基因克隆、载体构建及转基因材料的获得

参考茄科基因组网站（https：//solgenomics.net上收录的烟草品种K326基因组信息，从K326的DNA中分离克隆磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（序列号：mRNA_136682），命名为NtPHGPX，利用ln-FusionHDCloningKit（Takara公司）将克隆到的基因连接于用ECORI和SalI双酶切后的表达载体PRI-eGFP，参照XING等2的方法，使用载体pKSE401构建NTPHGPX基因敲除载体，将T-PHGPX-F和T-PHGPX-R稀释成50umol/L，加入5×DNA寡核苷酸退火缓冲液（碧云天生物技术公司）退火形成双链DNA，使用BsaI（NEB公司单酶切pKSE401载体，回收酶切产物，利用T4连接酶将靶位点连接到酶切后的pKSE401载体上。将构建好的载体转化至大肠杆菌DH5，阳性克隆进行菌落PCR及测序验证，提取质粒采用热激法转化农杄菌感受态细胞EHA105。采用葉盘法转化净叶黄品种，获得过表达T2代株系及基因敲除位点纯合突变体。在靶位点上下游设计引物，PCR扩增靶位点附近序列，将序列与野生型进行比对，靶位点比对无差异说明未编辑，靶位点是双峰说明是编辑杂合状态，靶位点纯合且有差异表明成功编辑且编辑位点纯合。本试验所采用的引物见表1。

1.3构建系统进化树

在美国国家信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI）数据库进行BLAST检索，下载拟南芥（arabidopsis thaliana）中已知的GPx蛋白序列，分别为ATGPX1（NP180080.1）、ATGPX2（NP_194915.2）、ATGPX3（NP001189742.1）、ATGPX4（NP_566128.1）ATGPX5（NP191867.1）、ATGPX6（NP192897.2）、ATGPX7（NP_194915.2）、ATGPX8（NP564813.1）、ATPEGPX（OAO9876），马铃薯（Solanum tuberosum）中STPHGPX（XP0151687441）栽培番茄（Solanumlycopersicon）中SIPEGPX（XP_004245287.1）、野生番茄（Solanum pennellii）中SPPHGPX（XP_0150846271）、辣椒（Capsicum annuum）中CAPIGPX（XP_016554525.1）;使用MEGA5.0软件对蛋白序列进行多序列比对，并用邻接法（Neighbor-joining method）构建系统进化树。

1.4实时荧光定量PCR

取100mg样品，加入液氮研磨匀浆，使用Trizol法提取植物RNA，用Hiscriptr II Q RT SupermixforQPCR（诺唯赞）反转录获得cDNA。使用Lightcycle96型荧光定量PCR仪（Roche公司）进行qRT-PCR，配置20L反应体系，其中2Chamq SYBRColor QPCR MasterMix（诺唯赞）10uL、dIHO7.2uL，cDNA2uL、上游引物（10 umoL）和下游引物（10 umol/L）分別0.4uL，NIPHGPR基因表达量检测引物和烟草内参基因p-actin检测引物序列见表1PCR反应程序为：95℃30s;95℃10s，60℃30s，40个循环;95℃10，65℃60s，97℃1s。每个反应3次重复。通过实时荧光定量PCR分析不同组织、盐胁迫下以及过表达株系叶片中NTPHGPX基因的转录水平。

1.5生理生化指标测定

使用丙二醛（MDA）测试盒、过氧化氢（H2O2）测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）测试盒（苏州科铭生物技术有限公司），按照说明书进行测定。采用硫代巴比妥酸比色法测定样品丙二醛含量2，采用硫酸钛比色法测定过氧化氢含量。GPx酶活性通过比色法测定NADPE的减少量确定。

1.6数据分析

使用SPSS21.0进行数据的显著性分析，采用LSD法进行多重比较，采用5%的统计检验标准使用GraphpadPrism8.0绘制图表。

2结果

2.1NTPHIGPX基因克隆和进化树分析

参考茄科基因组网站上序列信息设计引物，从烟草品种K326的cDNA中进行克隆，电泳结果（图1）显示克隆出的片段大小约为585bp，与预期结果一致。序列比对结果表明，该序列与参考序列完全一致，将其命名为NTPHGPX。该片段编码195个氨基酸，推测蛋白质分子量21.7kDa，等电点位971。系统发生树和序列分析结果表明，VTPHGPR中含有GPx家族的保守结构域，其与马铃薯中预测为PHGPX蛋白的序列亲缘关系最近，其次为番茄中PHGPX，但与拟南芥中已知的GPx蛋白和PHGPX蛋白亲缘关系较远，并非同源基因（图2A，B）。

2.2NTPHIGPX基因受到盐胁迫诱导

图3A结果表明，NTPHIGPX基因在根茎叶中都有表达，且在叶中表达量显著高于根和茎中，表达量分别为后两者的1.66倍和1.74倍。图3B结果表明，NtPEGPX基因表达量明显受到NaC溶液处理的诱导，在处理3h后其表达量比处理前升高了120.01%;而盐处理24h后，其表达量则大幅升高了4倍左右。该试验结果表明NTPHIGPR基因可能在烟草对盐胁迫响应中发挥作用。

2.3NIPHGPX过表达促进烟草在盐胁迫下根的生长

利用NTPEIGPX过表达T2代株系OX-1

（Overexpression line1），OX-2（overexpression line2）及基因敲除纯合株系Ci进行表型鉴定。两个过表达株系OX-1、OX-2的表达量分別为野生型的7.21倍和5.52倍（图4A）。对CRISPR/Cas9系统编辑材料的突变位点进行PCR扩增，结果显示基因敲除纯合株系Ci在靶位点插入一个碱基G，造成编码氨基酸发生移码，导致肽链提前终止（图4B）。

将野生型及转基因材料分别在正常条件和NaCl胁迫下处理（图4C，D），在不加NaC的MS培养基上，野生型烟草、过表达株系OX-1、OX-2、基因敲除株系Cri之间根长无显著差异;在含有150mmol/LNacl的MS培养基上，野生型烟草根的生长受到明显抑制，比正常条件下的野生型植株根长减少28.16%，而两个过表达株系根的生长未受到抑制;基因敲除株系Ci在NaCl胁迫下根长更短，相比正常MS培养基上的C株系减少了46.00%。上述结果表明，过表达NTPEGPX能够增强烟草对盐胁迫的耐性。

2.4NTPHGPX过表达对盐胁迫下烟草叶片中GPx酶活性、H2O2和MDA的影响

图5结果显示，正常条件下，野生型与转基因材料叶片中GPx酶活性无显著差异，NaC处理诱导野生型植株叶片中GP酶活性显著提高，酶活性比正常条件下升高约69.68%;NaC处理同样导致过表达和基因敲除株系中GPx酶活性升高，但在基因敲除株系C中，GPx酶活性升高的幅度较低，显著低于野生型WT和过表达株系OX-2。

正常条件下，野生型与转基因材料体内H2O2含量无显著差异，而盐胁迫下野生型植株叶片内H2O2含量大幅增加了70.74%，过表达材料叶片内H2O2含量也表现为上升的趋势，但HO2含量显著低于野生型对照，并与正常条件下野生型没有显著差异，这表明过表达NTPHIGPX基因对清除盐胁迫下H2O2的积累具有一定的作用;基因敲除株系Cri中H2O2积累显著高于其他材料，相比正常条件下的增加了114.139%（图6A）。正常条件下，野生型与过表达材料间MDA含量差异不显著，但基因敲除株系Cn的MDA含量显著高于野生型。盐胁迫下，野生型植株叶片内MDA含量明显上升，增幅16.20%;过表达材料MDA含量无明显上升，而基因敲除材料MDA含量增幅较大，加了19、54%，且MDA含量显著高于野生型和过表达材料（图6B）。试验结果表明，在盐胁迫下煙草需要NTPHGPX基因清除过氧化物，维持细胞膜的氧化还原平衡。

3讨论

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPX）是生物体内一种重要的抗氧化酶，在动植物中均有存在。研究表明PHGPX能特异性地还原氧化的磷脂和脂肪酸，而磷脂是细胞膜的重要组成成分，因此PIGPX对修复细胞膜的氧化损伤具有重要作用2。本研究克隆了一个烟草中的NtPHGPX基因，发现其具有GPx家族的保守结构域，系统进化分析发现其与茄科代表作物马铃薯、番茄等中的PIGPX亲缘关系较近，而与拟南芥中已知的GPx家族关系较远（图2），表明NTPHGPR可能是拟南芥中所不具有的一类GPx基因，其功能值得进一步研究。有研究表明植物中PHGPX表达量受到多种胁迫反应诱导。WANG等28发现在盐生植物盐爪爪（Kalidium foliatum）中PHGPX基因在不同浓度NaCl处理后表达水平显著增加;LI等2从水稻中分离到一个PHGPX基因，在H1O2和A处理后表达明显提高;SUGMOTO等在拟南芥中克隆到个可能的PEGPX基因，在NaC和AFe处理后表达量同样受到诱导。与上述研究结果一致，本研究发现在烟草中NTPHGPX在盐胁迫的诱导下表达量明显提高（图3B），说明PHGPX可能参与植物对不同逆境胁迫的响应。进一步研究表明，过表达NTPHGPR能够促进烟草幼苗在盐胁迫培养基上根的生长，而NTPHGPX敲除株系根的生长则对盐胁迫更敏感（图4C，D），这暗示了NTPHGPR可能在烟草抵御盐胁迫中起正向调控作用。

植物在遭受逆境胁迫时往往会产生大量的活性氧物质，过量的活性氧会破坏膜结构稳定性和完整性，对细胞造成损害。植物能够通过包括GPx在内的多种酶促反应系统清除体内过量的活性氧，维持细胞内的氧化还原稳态。作为GPx家族成员，PHGPX对逆境胁迫的影响可能与其活性氧物质清除能力相关。本研究中总GPx酶活性在过表达株系与野生型材料中均受到盐胁迫的显著诱导，但二者之间没有显著性差异（图5），这可能是由于烟草体内含有多种GPx同工酶，过表达一种VTPHGPX对烟草体内GPx酶总活性的影响有限。更为重要的是盐胁迫下敲除株系中GPx酶活性显著低于野生型，与之相对应的，盐胁迫处理下NTPHIGPX基因敲除株系中H2O2和MDA的含量则显著高于野生型（图6）。与本研究结果类似，胡杨中PEGPX基因过表达后在盐胁迫培养基上也表现为根长更长且GPx酶活显著高于野生型，这表明NTPHGPX在盐胁迫下植物清除活性氧物质的过程中起到重要的作用。与此同时，还有研究表明水稻中OSPHGPR过表达可提高水稻抵御百草枯氧化伤害的能力3，茶树中CSGPX1（属于PHGPX）基因的过表达可提高体内GPx酶活性，从而增加茶树的耐旱性2，而原核表达萝卜RSPHGPX和谷胱甘肽共同作用可以减少小鼠NH3T3细胞氧化损伤3，这些研究表明PHGPX可能与植物抵御盐害、干旱、除草剂等逆境引起的氧化胁迫均有关，但其参与的盐胁迫响应途径是如何被上游基因调控等科学问题仍需更加深入的研究。

4结论

本研究首次从烟草中克隆了一个磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因NTPEGPX，发现其表达受盐胁迫诱导。在盐胁迫下，烟草NTPEGPX过表达株系根长显著长于野生型，MDA和H2O2积累较野生型低;而敲除株系根长显著短于野生型，MDA和H2O积累较野生型显著升高。研究结果表明，NIPEGPX可能通过清除活性氧积累造成的过量脂质过氧化物，从而维持植物体内膜的氧化还原平衡，进而增强烟草的耐盐性。本研究初步揭示了NTPHGPX的耐盐功能，为培育和改良优质高产耐盐烟草新品种提供一定理论基础，但其参与的盐胁迫响应途径是如何被上游基因调控等仍需更加深入的研究。

参考文献

[1] GUAN C， LI X， TIAN D， et al. Adp-ribosylation factors improve biomass yield and salinity tolerance in transgenic switchgrass （Panicum virgatum L.）[J]. Plant Cell Reports， 2020， 39（12）1623-1638

[2]王佺珍，刘情，高娅妮，等植物对盐碱胁迫的响应机制究进展生态学报，2017，37（16）：5565-57

[3] PARIDA A K， DAS A B. Salt tolerance and salinity effects on plants a review[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2005， 60（3）324-349

[4] CHEN D， YIN L， DENG X， et al. Silicon increases salt tolerance b influencing the two-phase growth response to salinity in wheat （Triticum aestivum L.）[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2014， 36（9）2531-2535

[5]杨莎，侯林琳，郭峰，等.盐胁迫下外源Ca2对花生生长发育、生理及产量的影响应用生态学报，2017，28（3）：894-900

[6]曹岩坡，代鹏，戴素英.盐胁迫对芦笋幼苗生长和体内Na，K，Ca2+分布的影响.西南大学学报（自然科学版），2014，36（10）：31-36.

[7]王程栋，王树声，胡庆辉，等NaC胁迫对烤烟叶肉细胞超结构的影响中国烟草科学，2012，33（2）：57-61

[8]王发展，金伊楠，李子玮，等.干旱胁迫下外源ALA对烤烟幼苗光合特性和抗氧化能力的影啊.中国烟草科学，2020，41（1）

[9] MILLER G， SUZUKI N， CIFTCI-YILMAZ S， et al. Reactive oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity stresses [J]. Plant Cell and Environment， 2010， 33（4）： 453-467

[10] ARBONA V， MANZI M， de OLLAS C， et al. Metabolomics as a too to investigate abiotic stress tolerance in plants. International Journal of Molecular Sciences， 2013， 14（3）： 4885-4911

[11] GONG B， WEN D， VANDENLANGENHERG K， et al. Comparative effects of Nacl and NAHCO3 stress on photosynthetic parameters nutrient metabolism， and the antioxidant system in tomato leaves Scientia Horticulturae. 2013. 157： 1-12

[12]薛鑫，張，吴金霞.植物体内活性氧的研究及其在植物抗逆方面的应用.生物技术通报，2013（10）：6-1

[13] AHANGER M A， TOMAR N S， TITTAL M， et al. Plant growth under water/salt stress： ROS production： antioxidants and significance of added potassium under such conditions [J]. Physiology and Molecular Biology of Plants， 2017， 23（4）： 731-744

[14] DEPEGE N， VARENNE M， BOYER N Induction of oxidative stress and Gpx-like protein activation in tomato plants after mechanica stimulation [J]. Physiologia Plantarum， 2000， 110（2）： 209-214

[15] ALHARBY H F， METWALI E M R FULLER M P， et al. The alteration of MRNA expression of SOD and GPX genes， and proteins in tomato（Lycopersicon esculent im Mill）under stress of NACI and/or Zno nanoparticles [J]. Saudi Journal of Biological Sciences， 201623（6）：773-781

[16] AVERY A M， AVERY S V. Saccharomyces cerevisiae expresses three phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidases [J]. Journal of Biological Chemistry， 2001， 276（36）： 33730-33735

[17]李文君，刘进元，赵南明.苦瓜谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶CDNA

的克隆及其特征分析.生物化学与生物物理进展，2001（6）908-911

[18]雷明光，张舒，张冰，等.谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶研究进展生物学通报，2005（5）

[19]杨晓东，刘进元.萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因结构及其调控序列分析（英文）生物化学与生物物理进展，2005（7）

649-656

[20]刘赛，刘硕谦，龙金花，等，茶树谷胱甘肽过氧化物酶编码基因CSGPXI功能分析.茶叶科学，2019，39（4）：382-391

[21] HERBETTE S， de LABROUHE D T， DREVET J R， et al. Transgenic tomatoes showing higher glutathione peroxydase antioxidant activity are more resistant to an abiotic stress but more susceptible to biotic stresses [J]. Plant Science， 2011， 180（3）： 548-553

[22] CHEN S R， VAGHCHHIPAWALA Z， LI W， et al. Tomato phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase inhibits cell death induced by Bax and oxidative stresses in yeast and plants[J]. Plant Physiology，2004，135（3）：1630-1641

[23] XING H， DONG L， WANG Z， et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants [J]. BMC Plant Biology， 2014， 14

[24] CUSTODIO-MENDOZA JA， VALENTE IM， RAMOS R M， et al Analysis of free malondialdehyde in edible oils using gas-diffusion microextraction [J]. Journal of Food Composition and Analysis， 201982：103254

[25]刘小为，陈忠林，沈吉敏，等.硫酸钛光度法测定OHO2体系中低浓度HO2中国给水排水，2010，26（16）：126-129

[26]乔新荣，张继英.植物谷胱甘肽过氧化物酶（GP）研究进展[J].生物技术通报，2016，32（9）：7-13

[27] IMAI H， NAKAGAWA Y. Biological significance of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase （PHGPX， GPX4）in mammalian cells JI. Free Radical Biology and Medicine， 2003， 34（2）： 145-169

[28] WANG Z G， ZHANG PX， SHAO Y T， et al. Molecular cloning and the expression pattern of a phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase in Kalidium foliatum under Nacl treatment. Russian Journal of Plant Physiology， 2020， 67（4）： 750-757

[29] LI W J， FENG H， FAN J H， et al. Molecular cloning and expression of a phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase homolog in Oryza sativa [J]. Biochim Biophys Acta， 2000， 1493（1）： 225-230

[30] SUGIMOTO M， SAKAMOTO W. Putative phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase gene from Arabidopsis thaliana induced by oxidative stress [J]. Genes Genetic Systems， 1997， 72（5311-316

[31]烏凤章.三个越橘品种对盐胁迫的生长和生理响应及耐盐性差异.植物生理学报，2019，55（1）：1638-1646

[32] GILL S S， TUTEJA N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry， 2010， 48（12）： 909-930

[33]王非，丁明全，邓澍荣，等.胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PEGPX基因的克隆及转化植株耐盐性分析.基因组学与应用生物学2012，31（3）：231-239

[34]宋建辉，李甜，吴秀云，等.OSPHGPX基因的过量表达增强水稻抗氧化能力.生物技术通报，2014（11）：107-11

[35]刘冠兰，李甜，刘进元，等，原核表达的萝トPHGPX和谷甘肽对NIH3T3细胞氧化损伤的联合保护作用.中国生物工程杂志，2010，30（9）：13-18