烟草NTBZIPO38的克隆、鉴定及表达模式分析

赵泽玉 李志远 孙晋浩 李东微 解敏敏 陈明丽 龚达平

摘要：碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子是植物中数量最多、最具有多样性的基因家族之一，对植物生长发育及胁迫响应具有重要作用。为探究烟草中bZIP转录因子的生物学功能，本研究在烟草K326中克隆得到一个bZP转录因子基因Vtbzipo38，并对其保守结构域进行分析，利用qRT-PCR技术检测了该基因的表达模式，进一步结合亚细胞定位及转录激活试验对其功能进行了初步鉴定。结果表明，NTBZIPO38含有典型的bZP结构域，亚细胞定位于细胞核中并具有转录激活活性。表达模式分析表明，NIBZIPO38在根中表达量最高（p《0.001），并在盐、干旱、冷、熱、脱落酸（ABA）等非生物胁迫下都有明显的表达量变化，在ABA处理下尤其明显（p《0.001）。因此，作为bZP家族中的一员，NTBZIPO38转录因子可能在烟草根系发育、ABA响应与非生物胁迫中扮演着重要的角色。

关键词：bZIP;烟草;转录因子;ABA;非生物胁迫

转录因子（Transcription Factor，TF）是指能够特异性结合启动子顺式作用元件，对靶基因转录具有促进或抑制作用的DNA结合蛋白叫，对植物生长发育起着非常重要的作用。bZIP转录因子是植物中最大的基因家族之一，它由一个高度保守的DNA结合域（N-X7-RK-X9）和保守度较低的亮氨酸拉链区组成，其中亮氨酸拉链区是bZIP转录因子的功能结构域，调节多种胁迫响应，例如光胁迫响应、病原体防御等。

随着生物信息学和基因组测序技术的发展，bZIP转录因子成为了研究的热点。目前，已在拟南芥中鉴定到78个bZIP转录因子，玉米中有125个bZIP转录因子，油菜中有247个bZP转录因子。拟南芥78个bZIP从进化关系上分为13个亚家族（A-M），同一亚家族具有相似的保守结构域与类似的功能，其中D亚族参与两个不同的生物进程：病原体防御和植物发育。目前对烟草bZP家族鉴定有所报道，但对其功能研究却相对较少。

烟草是茄科的一种重要经济作物，由外界环境引起的生物和非生物胁迫对烟草品质及产量有重要影。研究烟草中bZP转录因子的保守结构域、进化关系、亚细胞定位和多种非生物胁迫下表达分析等具有重要意义。因此，本研究通过比较基因组学的方法对烟草bZIP家族的基因进行功能鉴定分析，为探究烟草bZIP转录因子的抗胁迫机制打下基础。

1材料与方法

1.1试剂和材料处理

试验材料：普通烟草K326。载体：PEASY-BluntZero载体，pCHF3-GFP，pbridge载体。菌株：农杆菌GV3101菌株，酵母AH109菌株。材料处理K326种子经消毒处理播种在装有灭菌土壤的花盆中，在幼苗长至6片真叶时，更换为MS液体培养液，培养5d左右后，对其进行胁迫和激素处理①将幼苗分别转移至50mmol/LNACI溶液和ABA溶液中进行盐处理与激素处理，处理1、3、6h后分别整株取样，以处理0h烟苗作为对照;②将幼苗分别转移至4℃与37℃培养箱中进行处理，处理1、3、6h后分別整株取样，以处理0h烟苗作为对照;③将幼苗转移至吸水滤纸上进行干旱处理，在1、3、6h的时间点分別整株取样，以处理0h烟苗作为对照。每个处理每次取3株生长状态近似的整株烟苗。待烟草生长至现蕾期，釆集植株的根茎、下部叶、中部叶、上部叶、腋芽、花的组织样品，每个组织取3次重复，在液氮中迅速冷冻后放置于-80℃冰箱中保存。

1.2生物信息学分析

以番茄Solyc05g009660.2.1（S/BZIP38）的蛋白序列为种子序列，在烟草参考基因组K326中进行Blastp序列比对，得到候选基因（NCBI上登录号XM_016595381.1）。利用EXPASY中的Protparam工具（https：/web.expasy.org/protparam）预测候选基因编码的蛋白氨基酸序列的分子量、等电点等基本理化性质;在PLANTTFDB（http：/planttfdb.cbi.pku.edu.cn）下载拟南芥和番茄的bZIP转录因子序列并进行多重比对分析，使用MEGA-X软件中的邻接法（Neighbor-.Joining，NJ）（1000Bootstrap）构建系统进化树，并通过MEME（http：/meme-suite.org/）分析其保守结构域。

1.3NTBZIP基因的克隆

将烟草在研钵中用液氮研磨为粉末，按照RNA提取试剂盒操作步骤提取植物总RNA并将其反转录为cDNA。依据候选基因CDS序列设计特异性引物进行PCR扩增，上游引物：5-ATGCAAGCTTTCAAAGCAGCA-3'，下游引物：5-CTAGAGTTGGTCCTGGGGC-3'。对符合大小的片段进行胶回收并与1LPEASY-BLUNT/连接转化至大肠杆菌中，用含有卡那霉素的LB平板进行筛选，将阳性克隆送至华大基因进行测序，测序正确的亚克隆载体命名为Blunt-NTBZIP038。

1.4亚细胞定位分析

以构建完成的亚克隆载体Bunt-Ntbz/PO38为模板，使用同源重组的方法将Ntbzipo38基因连接到pCHF3-cGFP亚细胞定位的载体上，转化大肠杆菌感受态T1，涂布到含有卡那霉素的LB平板上进行筛选，挑选阳性单克隆进行菌液PCR和测序验证，提取测序正确的重组质粒并转化到农杆菌GV3101中，经菌液PCR鉴定后将阳性农杄菌注射到烟草叶片的背部，培养72h后，取下叶片，在激光共聚焦显微镜下观察GFP信号。

1.5转录激活试验

以构建完成的亚克隆载体Blunt-NTBZIPO38为模板，使用同源重组的方法将Vtbzipo38基因连接到pbridge载体ECORI位点中转化大肠杆菌感受态T1，涂布到含有卡那霉素的LB平板上进行筛选，挑选阳性单克隆进行菌液PCR和测序验证，提取测序正确的重组质粒与对照pbridge空载分别转入酵母AH109菌株感受态中，在SD）-Ip营养缺陷培养基上生长，30℃培养48h，筛选阳性克隆转移至显色培养基SD/-TrpX-gal上倒置避光培养直至显色。

1.6表达模式分析

以烟草26STRNA基因作为管家基因，根据NTBZIPO38编码序列设计定量引物，Ntbzipo38上游引物为：5-AGCTGCGCCTACTTGT！-3，下游引物为：5-CACCTTCCGCAGGAGTCTI-3。总反应体系为20L，反应步骤：95℃30s;95℃5s，60℃34s，循环40次。具体步骤参考7500芡光定量仪说明书，最后根据2AC法计算基因的相对表达量。

2结果

2.1NTBZIPO38转录因子的系统进化和保守结构域分析

利用拟南芥、番茄中已被鉴定的bZIP轉录因子与MbZPの38进行多序列比对，用MEGA-X软件构建系统进化树，分析其亲缘关系。系统进化分析表明（图1），烟草Ntbzipo38与拟南芥Atbzip46、番茄Solyd5g0096602.1聚在一起，同属于D亚族。保守结构域MEME分析表明（图2），NTBZIPO38含有一个高度保守的DN识别结构域（N-X7-RK）及亮氨酸拉链区（-X9-L-X6-L-X6-L），可能参与植物防御反应或植物发育。

2.2Ntbzipl38基因全长的克隆及理化性质分析

以普通烟草K326的cDNA为模板进行PCR扩增，目的条带大小约为1400bp（图3），将其命名为NTBZIPO38。将目的片段回收纯化后连接至peasy-Blunt克隆载体进行序列测定。测序结果显示NTBZIPO38的CDS序列全长为1464bp，编码487个氨基酸。NTBZIPO38的蛋白序列含有完整的bZIP结构域，是一个典型的bZP家族蛋白。利用Protparam工具分析Ntbzipo38的理化性质，该蛋白的相对分子质量为53.38kDa，理论等电点为6.73。

2.3NTBZIPO38转录因子的亚细胞定位分析

将构建完成的35S-NTBZIPの38-GFP融合表达载体转化到农杆菌GV311中，以35GFP为空白对照，利用瞬时表达的方法注射到烟草叶片中，利用激光共聚焦显微镜观察NTBZIPO38的亚细胞定位。利用DAPI染色指示细胞核，结果如图4所示，融合Ntbzipo38的GFP信号只能在细胞核中观察到，而空载的GFP信号则遍布整个细胞，证明NTBZIPO38是一个核定位蛋白。

2.4NTBZIPO38转录因子的转录激活分析

为了进一步验证MbZP38的转录活性，将GAL4BD-NTBZIP038载体转化至酵母AH109菌株中，以GAIL4BD空载为对照，经SD-ITp平板上筛选后转至显色培养基（SD/-Ip/X-gal）上进行转录激活验证。从图5可以看出，含有Ntbzipo38的GAIL4BD-NbZPの38融合表达载体与空载GAL4BD均能够在SD/-Ip上生长，而只有GAL4BD-NTBZIPO38融合表达载体オ能够启动报告基因表达进而显示蓝色，说明NTBZIPO38具有转录激活活性。

2.5NTBZIPO38转录因子的表达模式分析

对烟草6个不同组织（根、茎、叶、花、芽、蕾）的Vtbzipl38表达量进行实时荧光定量PCR检测（图6），结果表明，Ntbzipの38在烟草的根、茎、叶、花、芽、花蕾组织中均有表达且在花蕾（FB）和根（R）中的表达量显著高于其他组织。

试验结果表明，Ntbzipo38的表达受多种胁迫的诱导。如图7所示，在盐胁迫的条件下，NTBZIPO38基因的表达量在处理1h达到最高（10.5倍），与对照0h相比差异极显著（p-0.001），随后表达量逐渐下降。NTBZIPの38在ABA处理条件下的表达模式与盐胁迫类似，均在1h达到最高（13.3倍），处理6h后表达量为对照的4.6倍。而在干旱胁迫下，NbZP38基因在处理3h时达到最高，其他处理时间的表达量略高于对照。NTBZIP38在高温胁迫条件下与在4℃冷胁迫条件下表达模式相反，高温胁迫下的Ntbzip038表达显著下调，而冷胁迫下NTBZIPO38表达高于对照，且在6h时达到最高，但差异幅度变化不明显（p-0.05）。NTBZIPO38的表达受多种胁迫的诱导，且在ABA处理条件下变化最大，表明Vtbzip038可能调控ABA合成代谢通路。

3讨论

bZP转录因子在植物发育、代谢和各种胁迫反应中起着重要作用。已有研究证实，在植物生长、衰老、损伤、花发育及种子成熟等生理生化过程都有bZP转录因子的参与。例如，拟南芥中AbZP9和ATBZIP46被证明参与了调控叶片、维管发育1分生组织与花器官的形成，Atbzip34和Atbzip46与其他bZIP成员互作调控植物发育叫。本研究对烟草NTBZIP38转录因子与拟南芥番茄bZIP家族进行进化分析，Ntbzipo38与Atbzip46同属D亚家族，且有高度相似性，推测Ntbzipo38可能主要在花与根的组织中表达。对NTBZIPO38根、茎、叶、花、芽、花蕾部位进行表达分析发现，其在根中的相对表达量最高，其次是花蕾，这与我们的猜测基本一致，Ntbzip038与Atbzip46高度同源使其具有了相似的功能，但对于其在花与根中的调节机制有待进一步研究。

植物在整个生长发育过程中，经常会遭受非生物胁迫，例如干旱、高温、低温等，这些非生物胁迫对植物生长发育有着直接的影响，因此植物也形成了各种反馈调节机制来适应生存环境的变化。目前对bZP转录因子的研究主要集中在逆境胁迫下的调控机制和功能上。研究表明，转OSBZIP72基因水稻抗旱性明显比野生型水稻强，过表达水稻中的DSBZIP7基因也有类似的功能。PEG模拟的干旱胁迫下，绿豆中的bZIP52表达量显著上调，表明bZIP52可能参与植株的干旱胁迫响应。玉米中的Zmbzip60和ZMBZIP72在拟南芥中过表达也能提高其对干旱和高盐的耐受力。我们对烟草在盐、干旱、温度胁迫下的定量处理表明，NTBZIPO38转录因子对干?、盐、低温表现为正调控，对高温表现为负调控。但在番茄中同属D亚家族的SIBZIP382在低温高温胁迫下均表现为正调控，这可能是不同物种在进化过程中出现了功能分化所导致的。

植物的抗逆调节离不开植物激素的作用。研究表明，植物在非生物胁迫下的抗逆调节机制通常依赖于ABA途径2。ABA是植物响应胁迫的激素之一，ABA应答主要是结合与ABA代谢相关基因启动子保守的ABRE顺式作用元件。CHOI2等首次从拟南芥克隆了bZIP家族A亚家族的转录因子Atbzip35，主要参与调控干早、高盐、ABA、氧化胁迫和高温胁迫。同时，拟南芥中的AmPP2（12通过ABA信号途径来提高抗旱能力。转玉米基因ZMBZIP72的拟南芥植株对干旱胁迫和盐胁迫抗性增强，同时对ABA和渗透胁迫的敏感性也增强。在茄科中，番茄SIAREB转录因子能结合ABRE元件响应ABA信号，提高抗旱性2。本研究中NTBZIPO38转录因子受ABA处理后表达量在1h之内高达13.3倍，与对照有极显著的差异，表明NTBZIPO38转录因子可能参与了ABA代谢通路的调控。

4结论

本研究利用比较基因组学的方法在烟草中克隆到一个bZIP转录因子NbZP038。对NTBZIPO38转录因子分析表明其含有典型的bZIP结构域，并将NTBZIPO38定位在细胞核，验证了NTBZIPO38具有转录激活活性。表达分析发现NTBZIPO38在烟草的根、茎、叶、花、芽、花蕾组织中均有表达，且在根中的表达量显著高于其他组织。在盐胁迫ABA处理、干旱和温度胁迫下均有明显的表达量变化，且在ABA处理下表达量变化最大，表明NTBZIPO38转录因子参与调控ABA通路并且在盐、干早、低温等非生物胁迫过程中发挥着重要作用。本研究初步探讨了烟草bZIP家族bZP38转录因子的功能，下一步应对其非生物胁迫下的调控机制进行研究。

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