下调miR-616-3p对补体攻击骨髓间充质干细胞的影响

周建国，刘如月，韩 枫，刘一亮

（1.商丘市第一人民医院骨一科，河南商丘476000；2.南华大学附属南华医院手足显微外科，湖南衡阳421002）

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）作为一类多功能干细胞，具有分化成多种细胞的潜能，如心肌细胞、成骨细胞、脂细胞等［1］。因而BMSCs能作为同种异体移植的种子细胞，参与多种细胞以及器官损伤等疾病的治疗［2］。但BMSCs的临床应用面临较多困难，例如BMSCs异体移植后存活率较低等。针对存活率较低的原因，目前认为可能是由于宿主补体系统识别并攻击BMSCs所致［4］。研究表明，补体系统的活化主要通过激活补体C3来实现，而膜补体调节蛋白如CD46、CD35以及CD55对活化物质C3b的分解起调节作用［5］。micorRNAs是一类由18～24个核苷酸组成的内源性非编码RNA小分子，能够通过与靶基因信使RNA互补序列结合抑制靶基因的转录，在转录后的调控中起重要作用［6］。有研究显示，抑制miR-616-3p表达能通过上调补体调节蛋白CD46促进人慢性髓原白血病细胞K562抵抗补体依赖的细胞毒效应［5］。因此，miR-616-3p可能通过调控CD46表达参与补体系统对BMSCs的攻击作用，但目前尚无相关研究。本研究通过构建miR-616-3p低表达的rBMSCs，探讨在大鼠异体血清（allogeneic rat serum,ARS）干预后，miR-616-3p低表达对rBMSCs存活的影响，并阐明miR-616-3p对ARS攻击rBMSCs作用产生影响的分子机制。

1 资料与方法

1.1 rBMSCs的分离及鉴定

SPF级健康雄性 Sprague Dawley（SD）大鼠 5只，鼠龄4-6周，体重（200.80±20.53）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2014-0010。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠，碘伏消毒后，从骨盆上离断取下股骨。将股骨置于碘伏内浸泡5 min后，剔除股骨周围软组织，剪断股骨。用含10%胎牛血清的DMEM培养液从截断处缓慢冲洗骨髓腔，收集冲下的骨髓细胞并制成细胞悬液。细胞悬液通过100 μm滤网过滤，1000×g离心5 min后，用PBS重悬细胞，800×g离心5 min，离心3次。将得到的rBMSCs细胞悬液于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养48 h后，更换培养液继续培养。随后每2 d换1次培养液，当细胞融合率达到80%后进行传代培养。取第3代rBMSCs细胞上流式细胞仪检测rBMSCs表面分子标志物CD29、CD44、CD45、CD34、CD90的表达水平。采用成骨诱导剂诱导第3代rBMSCs成骨分化21 d，再使用茜素红和碱性磷酸酶染色观察rBMSCs成骨分化情况。

1.2 细胞转染

将rBMSCs细胞以1×105个/ml的密度接种于6孔板中，待细胞生长至60%时进行转染。将预先备好的Lipofectamine 2000与miR-616-3p抑制剂或阴性对照（含有一段无意义的对照序列）试剂混合液加入rBMSCs细胞培养板中，分为rBMSCs空白对照组（blank），阴性对照组（NC，转染阴性对照序列）和miR-616-3p抑制剂组（抑制剂组，转染miR-616-3p抑制剂）。然后在37℃、5% CO2培养箱中培养4～6 h后更换新鲜培养液继续培养。

1.3 血清制备以及与rBMSCs共培养

取大鼠颈静脉血5 ml，4℃静置1 h后低温1 000×g离心20 min，取上层血清保存至冷冻备用。按后续实验要求进行分组：①对照组（Control），rBMSCs不经任何处理；②ARS干预组（ARS），采用10%的ARS与rBMSCs共孵育；③NC+ARS组：采用10%的ARS与转染NC后的rBMSCs共孵育；④抑制剂+ARS组：采用10%的ARS与转染miR-616-3p抑制剂后的rBMSCs共孵育。共培养条件为37℃下共孵育2 h。

1.4 qRT-PCR检测miR-616-3p的表达水平

使用TRIzol试剂盒提取各组rBMSCs总RNA。采用逆转录试剂盒合成cDNA，用SYBR绿色荧光实时定量PCR试剂盒进行定量PCR检测，内参基因为U6。所用引物 miR-616-3p-F：5′-ACACTCCAGCTGGGAGTCATTGGAGGGTT T-3′；miR-616-3p-R：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′； U6-F： 5′-CTCGCTTCGGCA GCA CA-3′； U6-R： 5′-AACGCTT CACGAATTTGCGT-3′。反应程序：95℃，5 min；95℃，15 s；60℃，10 s；72℃，20 s；40个循环；65℃，5 Sec；95℃，50 Sec。采用 2-ΔΔCT法计算 RNA相对表达量。

1.5 Western Blot检测CD46和cleaved Caspase-3蛋白的表达水平

取收集各组rBMSCs细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度后高温变性。SDS-PAGE凝胶电泳后转印至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉室温封闭处理1h后，加入一抗cleaved Caspse-3（1∶500）、CD46（1∶1 000）和GAPDH（1：1 000）低温孵育过夜，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗goat anti rabbit IgG（1∶10 000）37℃孵育1 h。ECL化学发光试剂盒显影，定影后进行拍照。结果用Image J软件进行灰度值的计算。

1.6 MTT检测细胞增殖

收集各组rBMSCs细胞，加入0.25%胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度5×103/ml，每孔100 μl细胞悬液接种于96孔板，37℃培养48 h后，每孔加入10 μl MTT（0.5 mg/ml）试剂并置于37℃孵箱中孵育4 h。使用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度（OD）值，计算细胞增殖活性。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡和补体攻击复合物（MAC）水平

收集各组rBMSCs细胞，加入0.25%胰酶消化成单细胞悬液，以2×104个/孔细胞接种于6孔板中。然后1000×g，4℃离心5min处理细胞后弃上清，加入1mL预冷的PBS洗涤2次后，加入200 μl Binding Buffer重悬细胞，然后分别加入10 μl Annexin VFITC和10 μl碘化丙啶（PI），混匀后4℃避光孵育30 min。立刻进入流式细胞仪检测细胞凋亡率。取重悬后的rBMSCs细胞后，加入FITC标记的兔抗鼠C5b-9在37℃孵育30 min后，立刻进入流式细胞仪检测MAC沉积情况。

1.8 双荧光素酶报告系统检测靶向关系

利用Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒将293T 细胞与 pGL3-CD46 3′-UTR WT/Mut质粒、miR-161-3p mimics/阴性对照共转染48 h。根据双荧光素酶报告系统试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0统计分析软件对数据进行统计分析，计量数据以平均值±标准差表示。两组以上组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 rBMSCs的鉴定

如图1显示，第3代rBMSCs细胞表面CD29、CD44和CD90呈阳性表达，阳性表达率分别为（90.74±3.18）% 、（91.82±2.91%） 和 （84.86±4.29）%；而CD34、CD45呈阴性表达，表达率仅为（3.12±1.12）%和（4.52±1.31）%。对第3代 rBMSCs细胞进行成骨诱导21 d后，茜素红染色结果显示rBMSCs出现大量橘红色钙结节，矿化能力增强；碱性磷酸酶染色结果显示rBMSCs细胞胞浆内出现大量蓝黑色沉淀，如图2所示。表明分离培养的细胞为rBMSCs。

图1 流式细胞术检测rBMSCs表面标志物的表达

图2 rBMSCs成骨诱导分化21 d后染色观察（×200） 2a:茜素红染色 2b:碱性磷酸酶染色

2.2 ARS干预诱导rBMSCs中miR-616-3p表达

与空白和NC组比较，抑制剂组rBMSCs中miR-616-3p的表达水平显著降低（P＜0.05）；与对照组比较，ARS组和NC+ARS组rBMSCs中miR-616-3p的表达水平显著升高（P＜0.05）；与NC+ARS组比较，抑制剂+ARS组rBMSCs中miR-616-3p的表达水平显著降低（P＜0.05），如图3所示。

2.3 抑制miR-616-3p表达对ARS干预的rBMSCs细胞增殖的影响

与对照组比较，ARS组和NC+ARS组rBMSCs中细胞增殖活性显著降低（P＜0.05）；与NC+ARS组比较，抑制剂+ARS组rBMSCs中细胞增殖活性显著升高（P＜0.05），如图4所示。

图3 各组rBMSCs中miR-616-3p的表达水平 1a:转染后rBMSCs中miR-616-3p表达水平 1b:被ARS处理的转染后rBMSCs中miR-616-3p表达水平 与对照组或空白组比较，*P＜0.05；与NC+ARS组比较，#P＜0.05

图4 各组rBMSCs细胞的增殖活性比较 与对照组比较，*P＜0.05；与NC+ARS组比较，#P＜0.05

2.4 抑制miR-616-3p表达对ARS干预的rBMSCs凋亡的影响

与对照组比较，ARS组和NC+ARS组rBMSCs凋亡率显著提高（P＜0.05），凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表达水平明显增加（P＜0.05）；与NC+ARS组比较，抑制剂+ARS组rBMSCs凋亡率显著降低（P＜0.05），cleaved Caspase-3的表达水平明显下降（P＜0.05），如图5所示。

2.5 抑制miR-616-3p表达对ARS干预的rBMSCs MAC沉积的影响

与对照组比较，ARS组和NC+ARS组rBMSCs中MAC沉积显著增高（P＜0.05）；与NC+ARS组比较，抑制剂+ARS组rBMSCs中MAC沉积则显著降低（P＜0.05），如图6所示。

2.6 抑制miR-616-3p促进rBMSCs中CD46蛋白的表达

与空白组和NC组比较，抑制剂组rBMSCs中CD46蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）；与对照组比较，ARS组和NC+ARS组rBMSCs中CD46蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）；与NC+ARS组比较，抑制剂+ARS组rBMSCs中CD46蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05），如图7所示。

2.7 CD46是miR-616-3p靶基因

通过TargetScan7.1生物信息软件预测结果显示，CD46 3’-UTR存在与miR-616-3p结合位点。双荧光素酶报告基因系统检测结果显示，与NC mimics组比较，miR-616-3p mimics转染293T细胞后，pGL3-CD46 3′-UTR WT的报告基因活性明显下降（P＜0.05），而 pGL3-CD46 3′-UTR Mut的报告基因活性差异无统计学意义（P＞0.05），如图8所示。

图5 各组rBMSCs凋亡水平比较 5a:流式细胞术检测细胞凋亡5b:Western blot检测cleaved Caspase-3表达水平 与对照组比较，*P＜0.05；与NC+ARS组比较，#P＜0.05图6 各组rBMSCs中MAC沉积水平比较 与对照组比较，*P＜0.05；与NC+ARS组比较，#P＜0.05图7 各组rBMSCs中CD46蛋白表达水平 7a:转染后rBMSCs中CD46蛋白表达水平 7b:被ARS处理的转染后rBMSCs中CD46蛋白表达水平 与对照组或空白组比较，*P＜0.05；与NC+ARS组比较，#P＜0.05

图8 CD46与miR-616-3p靶向调控关系 与NC mimics组比较，*P＜0.05

3 讨论

研究表明，BMSCs具有较强的增殖能力和较低的免疫特性，是组织工程种子细胞的最佳来源［7］。在特定条件下，BMSCs可以分化为骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等［8］。BMSCs不仅能分泌多种神经生长因子，而且能促进局部血管生成和血管重塑［9］。然而，补体系统、肿瘤等潜在因素会影响BMSCs的增殖和分化，如何缓解或避免这些潜在的因素，还需要更加深入的探索。

补体系统在自身免疫性疾病的病原发生中起着复杂的作用［10］。补体系统由三个不同的级联组成：经典的、替代的和凝集素补体途径。所有这些级联都集中在C3转化酶的形成上传播补体级联。有报道称，补体系统C3中心成分的缺失显著降低了移植物抗宿主病（GVHD）相关的死亡率和发病率，C3调节小鼠GVHD中Th1/Th17的极化率［11］，表明补体系统的缺失有助于抗GVHD相关的损伤。BMSCs与自体血清孵育后有细胞损伤，并且检测到补体激活诱导的补体膜攻击复合物（MAC）的形成［12］，提示补体可以识别自体BMSCs并攻击它。本研究发现，异体血清能抑制rBMSCs细胞增殖，促进细胞凋亡和MAC沉积。说明补体系统对骨髓间充质干细胞的增殖凋亡有明显作用，并且该作用与补体激活后产生的膜攻击复合物MAC的沉积相关。

补体激活主要由补体调节蛋白调控，膜补体调节蛋白在不同细胞群中广泛表达，是维持补体级联稳态的蛋白质［13］。膜补体调节蛋白CD46通过充当因子I（FI）介导的C3b裂解的辅因子蛋白来调节C3的活化。研究发现重组的免疫特性分子CD46能降低补体激活引起的血清溶血以及杀菌活性，提示CD46对补体激活具有负调节作用。进一步观察到重组的免疫特性I因子（FI）显著降低了CD46对补体系统的抑制作用，这很可能是由于血清中天然免疫特性FI的抗体阻断所致。CD46能够与FI直接相互作用，形成CD46-FI复合物，进而调控补体活性［14］。CD46作为一种膜结合的辅因子，通过其控制补体激活的能力，在保护宿主细胞免受补体攻击中发挥作用，但上游分子调控机制尚不清楚。

miRNAs能通过抑制靶基因的翻译参与调控转录后表达水平［15］。miRNAs参与了许多病理生理过程，如细胞生长、器官发生、侵袭、迁移和凋亡［16］。有研究发现，miR-616-3p靶向组织因子途径抑制物2（tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI2）调控胎盘组织细胞的生长和迁移［17］。而且，miR-616-3p还能通过调控CD46的表达影响人慢性髓原白血病细胞K562对补体系统的抵抗［5］。说明miR-616-3p参与了补体系统对细胞的攻击作用。本研究发现，异体血清能下调膜补体调节蛋白CD46，并且上调miR-616-3p的表达，说明miR-616-3p和CD46参与了异体血清对rBMSCs细胞攻击作用。该结果验证了CD46对补体系统的调控作用，而且还发现了CD46的转录水平调控因子miR-616-3p，进一步探讨miR-616-3p对CD46以及补体系统的作用，结果发现抑制miR-616-3p能显著上调CD46的表达水平，并且能明显减弱异体血清对rBMSCs的攻击作用。另外，双荧光素酶结果显示，miR-616-3p与CD46靶向结合。因此，miR-616-3p可能通过靶向调控CD46表达影响异体血清对rBMSCs细胞的攻击作用。

综上所述，抑制miR-616-3p表达可能通过靶向上调CD46表达，进而抑制补体系统对BMSCs细胞的攻击作用。