高血压及高血压合并糖尿病的患者血浆可溶性NRP-1与SOD浓度的变化

余舒杰，刘定辉，宋志明，钱孝贤，3

（1.中山大学附属第三医院心内科，广东广州 510630；2.河南大学第一附属医院心内科，河南开封 475001；3.中山大学中西医结合研究所，广东广州 510630）

血管生成（angiogenesis）是胚胎期血管网络发育、器官生长、组织修复和血管重塑等过程的必经步骤，在这一过程中多种细胞因子发挥重要的调控作用，如血管内皮细胞生长因子（vascular endotheli⁃al growth factor，VEGF）及其受体血管内皮细胞生长因子受体1（vascular endothelial growth factor recep⁃tor 1，VEGFR1）/血管内皮细胞生长因子受体2（vas⁃cular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）和神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP-1）等［1］。NRP-1 是一个分子量为120～130 ku 的Ⅰ型单次跨膜糖蛋白，由一个多结构域胞外区、一个跨膜螺旋和一个胞质区3部分组成［2］。NRP-1最初在青蛙的神经系统内被发现，它是一种多功能的跨膜糖蛋白，无论在生理或者病理条件下它都可作为多种生长因子或其他配体的共受体而发挥不同的生物学功能，它在神经、血管、肿瘤和免疫等系统都发挥着重要作用［3-5］。NRP-1 在新生血管的内皮细胞上持续高表达，作为VEGF 的同工型VEGF165 的共受体能够通过VFGFR2 在血管生成的过程中加强靶细胞的迁移，诱导血管增生，对血管形态的形成至关重要，因此它在心血管系统发育过程中起着重要作用［6］。但是既往研究发现，NRP-1 蛋白在糖尿病患者肾组织中的表达明显减少［7］。目前可溶性NRP-1 在糖尿病和高血压患者血浆中的浓度尚不十分清楚。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）作为一种抗氧化剂，能清除生物体内活性氧自由基，是机体氧化应激的主要生物分子。众所周知，糖尿病和（或）高血压患者机体内都存在过度的氧化应激，所以其血浆SOD的活性可能会有所改变，但其变化的趋势目前尚有争议［8］。我们既往研究发现，高血压及高血压合并糖尿病患者的血浆可溶性VEGFR2 水平较健康对照组均显著降低，且与SOD 呈正相关［9］。NRP-1 作为VEGFR2的共受体，两者关系密切且能发生相互作用，共同发挥调控血管增生的作用［10］。因此，本研究旨在观察高血压及高血压合并糖尿病患者的血浆可溶性NRP-1 的浓度和SOD 活性的变化，并进一步探讨两者的相关性。

1 材料与方法

1.1 目标人群分组及排除标准

整体人群来源于2012年12月至2013年1月来我院体检的石牌村村民。从该体检人群选取88 人作为研究对象，将其分为3 组：正常对照组（n=26），高血压组（n=31）和高血压合并糖尿病组（n=31）。正常对照组为目前和既往均没有诊断高血压和（或）糖尿病的健康人群。《中国高血压防治指南2010》的高血压定义为：在未服用降压药物的情况下，非同日3次测量血压，收缩压≥140 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg［11］。该研究的高血压人群严格按照该指南的高血压定义入选。《中国2型糖尿病防治指南2013》糖尿病的诊断标准为：①多尿、烦渴多饮和难于解释的体质量减轻的糖尿病症状加随机血糖≥11.1 mmol/L 或②空腹血糖≥7.0 mmol/L或③口服葡萄糖耐量试验2 h血糖≥11.1 mmol/L［12］。本研究的糖尿病人群严格按照该指南的2 型糖尿病诊断标准入选。同时3 组研究人群的排除标准为：目前有肝肾功能异常的人群；正在服用降压、降糖及调脂药物的人群；存在不稳定心血管疾病人群（如不稳定心绞痛、有过心肌梗死病史、充血性心力衰竭等）；有脑血管疾病的人群；体检发现肿瘤或有肿瘤病史的人群；本次体检资料不完整的人群。本研究获得中山大学附属第三医院伦理委员会批准，所有患者均已签署知情同意书。

1.2 血标本的准备与测定

经外周静脉抽取血标本10 mL，等分于干燥管和抗凝管中，干燥管中的血标本用于常规生化检查。血脂检测利用7180A 型全自动生化分析仪（日立）检测；采用葡萄糖氧化酶法进行血浆葡萄糖测定，试剂购于保定长城临床试剂有限公司，通过分光光度分析法（上海精密科学仪器有限公司721 分光光度仪）分析数据；糖化血红蛋白用离子交换高效液相色谱法测定，仪器为美国Bio-Rad公司D-10。血标本收集到抗凝管中，以3 000 r/min（r=50 cm）离心10 min 后吸取上清液，分装保存于-80 ℃冰箱以供后续使用。3组人群血浆的可溶性NRP-1 的浓度和SOD 的活性经酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）测定，检测试剂盒均购自英国艾博抗（Abcam）公司。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 软件对数据进行统计学处理。服从正态分布的连续性资料以平均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），通过LSD-test 进行均数的两两比较。非正态分布的连续变量以中位数和四分位数，即P50（P25～P75）表示，多组比较采用Kruskal WallisH检验。分类变量采用数字和率表示，其组间比较采用卡方检验。分别绘制三组研究数据的散点图，并分别计算简单线性回归方程和相关系数（r）计算。P<0.05 被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究人群的临床和生化指标的变化

本研究选取88 人，分为正常对照组（n=26）、高血压组（n=31）以及高血压合并糖尿病组（n=31）等3 组。结果发现，单纯高血压组血清总胆固醇（total cholesterol，TC）和体质量指数（body mass index，BMI）较对照组显著性升高（P<0.05）；而高血压合并糖尿病组血清TC、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）、BMI 和腰围（waist circumfer⁃ence，WC）均较对照组明显升高（P<0.05）。单纯高血压组和高血压合并糖尿病组血浆可溶性NRP-1的浓度和SOD 的活性均较对照组显著性降低（P<0.05），而高血压合并糖尿病组较单纯高血压组血浆可溶性NRP-1 的浓度和SOD 的活性更低（P<0.05），且差异也有统计学意义（表1）。

2.2 研究人群血浆可溶性NRP-1 浓度与SOD 的相关情况

将研究人群分为正常对照组（n=26）、高血压组（n=31）以及高血压合并糖尿病组（n=31）等3 组，应用各组人群的血浆可溶性NRP-1 浓度与SOD 的数据分别绘制散点图，并分别计算其简单线性回归方程（图1）。对3 组研究人群进行相关性分析发现，可溶性NRP-1 的浓度与SOD 的活性之间均呈显著性正相关（P<0.05，表2）。

3 讨论

本研究发现正常对照组人群血浆可溶性NRP-1的浓度为7.7～10.0 ng/mL，而国内有研究报道健康成年人血清NRP-1 的浓度为8.7～9.9 ng/mL，这与我们的研究结果基本相符［13］。我们的研究人群分为正常对照组（26 人）、高血压组（31 人）及高血压合并糖尿病组（31 人），结果发现单纯高血压组和高血压合并糖尿病组患者血浆可溶性NRP-1 浓度均较对照组显著减低，而高血压合并糖尿病组患者血浆可溶性NRP-1 浓度较单纯高血压组更低。众所周知，糖尿病患者血管新生能力与健康人群相比明显下降，本研究结果说明糖尿病合并高血压患者血浆中可溶性NRP-1 浓度的下降可能是导致糖尿病患者血管生成功能紊乱的又一个重要机制。既往对肥胖糖尿病小鼠的肌肉组织研究也有类似的发现，Stephan等［14］研究发现肥胖糖尿病小鼠的肌肉组织的NRP-1 表达水平较非糖尿病小鼠显著下降，这可能是糖尿病小鼠血管生成能力损害的一个机制。而Kivelä 等［15］研究也发现1 型糖尿病小鼠肌肉组织NRP-1 mRNA 表达水平较对照组小鼠显著下降，同时伴有骨骼肌血管生成能力的损害，且运动训练可以逆转小鼠肌肉组织表达NRP-1 mRNA水平下降的作用。我们研究已发现高血压及高血压合并糖尿病患者的血浆可溶性VEGFR2 水平较健康对照组降低，而NRP-1 可通过强化VEGFR2与VEGF165结合而促进血管生成，所以NRP-1 和VEGFR2 两者关系密切［9，16］。在高血压及高血压合并糖尿病患者中，本研究也发现血浆可溶性NRP-1浓度均低于对照组。血浆可溶性NRP-1 可能是多种组织器官如心、肺、肝等的内皮细胞NRP-1 蛋白细胞外域脱落的产物［17］，而患者血浆较组织或细胞更易方便获得，所以血浆可溶性NRP-1 水平可作为机体组织或细胞NRP-1 蛋白表达水平的间接反映。有研究发现，它可能通过拮抗VEGF165而发挥抑制血管生成作用［18］，所以本研究发现在高血压和高血压合并糖尿病患者血浆可溶性NRP-1 浓度降低可能是血压升高的一个机制［19］。

表1 研究人群的临床和生化指标一览表Table 1 Clinical and biochemical parameters of the whole group.

图1 三组研究人群血浆中neuropilin-1浓度与SOD的散点图和简单线性回归方程Fig.1 Scattergram and simple linear regression equation of plasma neuropilin-1 concentration and SOD in three study groups

表2 三组研究人群血浆中neuropilin-1浓度与SOD的相关情况Table 2 Correlation between plasma neuropilin-1 con⁃centration and SOD in three studies

Ceriello 教授提出“共同土壤学说”，认为氧化应激是胰岛素抵抗、糖尿病和心血管疾病的共同发病基础［20-21］。众所周知，SOD 是一种抗氧化剂，它能清除有害的活性氧自由基，在氧化应激过程中发挥着重要作用。而本研究也发现，血浆SOD的活性在单纯高血压和高血压合并糖尿病患者中均较正常对照组降低，且高血压合并糖尿病患者较单纯高血压患者更低。国内临床研究也有类似发现，他们研究发现在原发性高血压和合并糖耐量减低患者血浆SOD 活性都较对照组降低［22］。最新国内研究也报道，高血压患者血清SOD 的活性较对照组下降，而且SOD的活性与高血压分级呈负相关［23］。也有动物实验研究发现，糖尿病小鼠主动脉组织的VEGFR2 蛋白表达减少，其中氧化应激起着重要作用［24］。而我们的研究也发现，高血压及合并糖尿病患者的血浆可溶性VEGFR2水平较对照组降低，且与SOD 的活性有正相关性［9］。既往多项研究证实NRP-1和VEGFR2二者关系密切，共同调节血管生成［10，16，25］。所以在本研究人群中发现血浆可溶性NRP-1 的浓度与SOD 的活性存在正相关，这提示高血压和高血压合并糖尿病患者血浆NRP-1 浓度降低可能与相应的SOD 活性降低有关。高血压和高血压合并糖尿病患者的血浆SOD 活性下降提示机体内存在过度的氧化应激，而NRP-1 在血管生成过程中具有重要作用，所以血浆SOD的活性与可溶性NRP-1 的浓度正相关性表明过度氧化应激与血管生成功能紊乱可能存在一定的联系。

我们的研究发现高血压和高血压合并糖尿病患者血浆可溶性NRP-1 的浓度均较正常对照组低，而NRP-1 在血管生成过程中具有重要作用，所以血浆可溶性NRP-1 浓度的降低可能是高血压和高血压合并糖尿病患者机体血管生成功能紊乱的一个重要生物学标志，而且血浆SOD 活性的下降可能是其中的一个重要机制，但是有关NRP-1与氧化应激相互作用的具体机制有待于进一步研究探讨。由于该研究样本量偏小，所以目前所得研究结果还需经扩大样本量的临床研究来进一步证实。