乳酸杆菌抑制致病菌及生物保鲜发酵剂特性评价

徐显睿，李翠凤，张宗博，夏文洋，隋勇军，李道河，陈政言，张兰威*

（1.青岛根源生物技术集团有限公司食品实验室，山东 青岛 266000；2.青岛诺和诺康实业有限公司，山东 青岛 266000；3.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266000）

乳酸杆菌是人体肠道优势益生菌群，具有维持肠道菌群平衡[1]、提高免疫力[2]、抑制有害菌生长[3]、预防致病菌引起的肠道疾病[4]等功能，对促进肠道和宿主健康有重要作用[5]。乳酸杆菌定植于肠道上皮细胞，代谢过程中产生有机酸、过氧化氢以及多糖、抗菌肽、细菌素等蛋白类抑菌物质[6-7]。有机酸可降低肠道pH值、过氧化氢的积累抑制致病菌生长，而蛋白类抑菌物质可直接杀灭致病菌。田芬等[8]研究表明，3 株乳双歧杆菌和2 株嗜酸乳杆菌对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌均有抑制作用；孙群等[9]发现，副干酪乳杆菌X11、K14对腐败荧光假单胞菌有很好抑制效果，经分析抑菌代谢物均为有机酸。傅容辉等[10]研究表明，5 株乳酸杆菌代谢产生细菌素等蛋白类物质和有机酸，对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌和荧光假单胞菌均表现出良好抑制作用。此外有研究表明，乳酸杆菌黏附性也可抑制肠道致病菌[11]。

由于乳酸杆菌抑菌性具有单菌株特异性[12]，且低温酸乳、风味发酵乳、乳酸菌饮料和干酪等发酵类乳品是乳酸杆菌产品消费产业链最重要的载体，尤其低温酸乳和风味发酵乳保持每年20%消费增长，因此将具有抑菌性的乳酸杆菌制成发酵剂，在防腐保鲜功能基础上使发酵剂的发酵性能适用于多种发酵乳制品的生产，具有较好的市场应用潜力。本研究中的乳酸杆菌是经耐胃肠液、细胞黏附性体外实验筛选、具有优良潜在益生效果的食品菌株[13]，通过抑制肠道致病菌作用评价各菌株抑菌效果，再经单菌株凝乳及产酸性能测试，筛选同时具有优良发酵和抑菌性能的菌株与嗜热链球菌ST-21制备组合生物保鲜发酵剂，评价各发酵剂特性，旨在为制备的生物保鲜发酵剂在发酵乳制品中的商业化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

15 株可用于食品中的乳酸杆菌（分别为Z-41、Z-5、Z-12、Z-15、Z-38、Z-39、Z-1、Z-8、Z-7、Z-17、Z-45、Z-46、Z-16、Z-40、Z-43）、嗜热链球菌ST-21、5 株指示菌株（单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌） 青岛根源生物技术集团有限公司；动物双歧杆菌乳亚种BB-12美国杜邦公司。

MRS肉汤培养基 北京陆桥技术股份公司；琼脂北京索莱宝科技有限公司；TSA-YE培养基、LB液体培养基 青岛海博生物技术有限公司；L-半胱氨酸盐酸盐（分析纯） 国药集团化学试剂（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-50SⅡ立式高压蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；AG050厌氧培养罐 广州雷得生物技术有限公司；SE6001FZH电子天平 美国奥豪斯公司；1-7离心机 德国Sigma公司；PHS-3C pH计上海仪电科学仪器股份有限公司；LRH-250生化培养箱上海一恒科学仪器有限公司；MX-S旋涡振荡器 美国赛洛捷克公司；756PC紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；iCinac乳品发酵检测仪 法国AMS Alliance公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

乳酸杆菌活化：将供试乳酸杆菌菌株按体积分数2%接种量接种到MRS肉汤培养基中进行活化（双歧杆菌属添加0.1%L-半胱氨酸盐酸盐），经2 次传代，37 ℃恒温培养箱中静置培养（双歧杆菌属厌氧培养）24 h后待用。

指示菌活化：将指示菌以体积分数2%接种量接种于LB液体培养基中（单核细胞增生李斯特氏菌接种到TSA-YE培养基），37 ℃培养24 h，活化2 代后用于后续实验。

1.3.2 无细胞抑菌活性上清液制备

将乳酸杆菌接种到液体培养基中，37 ℃培养24 h，于4 ℃、8 000×g离心10 min，取上清液，用0.22 μm滤膜去除菌体和其他杂质后4 ℃保存备用。

1.3.3 乳酸杆菌抑菌能力测定及排除有机酸实验

将指示菌稀释至107CFU/mL，用移液枪取0.1 mL菌悬液接种到相应指示菌固体培养基中，混匀后用无菌涂布器涂至均匀。将3 个无菌的牛津杯均匀放置在培养皿中，取1.3.2节上清液0.2 mL注入牛津杯中（排除有机酸实验需用1 mol/L NaOH将1.3.2节上清液pH值调整至6.0），在4 ℃冰箱中扩散2 h后37 ℃培养24 h，观察并用游标卡尺测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径大小评价抑菌能力。

1.3.4 乳酸杆菌凝乳及产酸性能测试

将1.3.3节乳酸杆菌接种到质量浓度12 g/100 mL灭菌脱脂乳中，按2%接种量发酵5 代，经37 ℃培养48 h，初步筛选出凝乳状态稳定的菌株。再将上述菌株按2%接种量接种到12 g/100 mL灭菌脱脂乳中，37 ℃发酵，采用乳品发酵检测仪测定发酵48 h内的pH值。

1.3.5 生物保鲜发酵剂产酸性能测试

表 1 组合菌种制备生物保鲜发酵剂配方Table 1 Formulation of bio-preservative starter cultures

将嗜热链球菌S-21与上述筛选出具有抑菌和优良产酸性能的乳酸杆菌组合制备生物保鲜发酵剂，按表1配方以3%接种量接种于灭菌脱脂复原乳中，于43 ℃发酵48 h，采用乳品发酵检测仪连续测定pH值。

1.3.6 生物保鲜发酵剂发酵乳质构测定

采用生物保鲜发酵剂在43 ℃发酵复原乳，当pH值至4.55左右时于4 ℃放置48 h，采用TAX-XT2i质构分析仪测定产品硬度、稠度和黏聚性。测定条件：选用A/BE探头，压力盘直径35 mm。设置参数：下降速率1.0 mm/s，测试速率1.0 mm/s，上升速率10.0 mm/s，测试深度30 mm，记录整个过程中所需应力。探入过程中的最大峰值为硬度（g），探头上行的负峰值为黏聚性（g），曲线正峰面积为稠度（g·s）。

1.3.7 生物保鲜发酵剂发酵乳感官评价

采用生物保鲜发酵剂在43 ℃发酵复原乳，当pH值至4.55左右时于4 ℃放置48 h，选择10 名具有感官评定经验的食品专业人员进行评分，感官评价标准如表2所示。

表 2 发酵乳感官评价标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of fermented milk

1.4 数据处理

采用OriginPro 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 乳酸杆菌对肠道致病菌抑制作用实验结果

由表3可知，菌株Z-41、Z-12、Z-38、Z-17、Z-45、Z-46、Z-16、Z-40和Z-43共9 株菌对5 株指示菌均有抑制效果，其中菌株Z-17对单核细胞增生李斯特氏菌抑菌效果最好，Z-12对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌抑菌效果最好，Z-38对肠炎沙门氏菌和大肠杆菌抑菌效果较好。除单核细胞增生李斯特氏菌外，菌株Z-5、Z-7对其余4 株指示菌均有抑菌效果，并且2 株菌对大肠杆菌抑菌效果也较好，抑菌圈直径分别为17.76、13.40 mm。菌株Z-8对肠炎沙门氏菌和大肠杆菌有抑制效果，Z-1和Z-15对大肠杆菌有抑制效果，但上述乳酸杆菌抑菌能力均明显高于动物双歧杆菌乳亚种BB-12（仅对大肠杆菌有抑制作用，抑菌圈直径为11.37 mm）。

表 3 乳酸杆菌抑菌作用结果Table 3 Antagonistic effect of Lactobacillus strains against pathogens

此外，实验结果还表明，上述乳酸杆菌排酸上清液对5 株指示菌均没有抑制效果，说明本研究中的乳酸杆菌对5 株指示菌产生抑菌效果的主要物质是有机酸类。Saleh等[16]研究表明，动物双歧杆菌乳亚种BB-12对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌有明显抑制作用，对单核细胞增生李斯特氏菌无抑制作用，与本研究结果不一致，可能与致病菌菌株特异性或动物双歧杆菌乳亚种BB-12经分离、活化传代导致性状突变有关。

2.2 乳酸杆菌凝乳及产酸性能测试结果

乳酸杆菌利用乳中乳糖生长代谢产生乳酸，降低复原乳的pH值，使酪蛋白达到等电点，进而使复原乳完全凝固，并且菌株在传代过程中，由于DNA复制基因存在突变，因此为使菌株发酵特性稳定，对菌株进行传代并分别评价其凝乳性能。

表 4 乳酸杆菌凝乳性能测试结果Table 4 Milk curding ability of 15Lactobacillus strains

图 1 乳酸杆菌产酸性能测试结果Fig. 1 Acid production ability of Lactobacillus strains

由表4可知，15 株乳酸杆菌的凝乳能力不同。菌株Z-41、Z-5、Z-15、Z-39、Z-1、Z-16在乳中48 h内基本不生长，而菌株Z-17则表现为凝乳状态不稳定，经2 次传代后凝乳能力消失。菌株Z-12、Z-38、Z-8、Z-7、Z-45、Z-46、Z-40、Z-43凝乳状态稳定，其中菌株Z-43凝乳状态一般，其他菌株凝乳状态较好。因此为保证制备的生物保鲜发酵剂能适合多种酸乳制品发酵、生产的要求，测定上述凝乳状态稳定的8 株乳酸杆菌发酵48 h的产酸速率，评价产酸性能。由图1可知，8 株乳酸杆菌在发酵48 h的产酸趋势基本一致。菌株Z-46、Z-7产酸速率较快，发酵24 h使复原乳pH值降至4.4左右，此时其他菌株的发酵复原乳pH值为4.6～5.0，基本使复原乳凝固。此外，在脱脂复原乳pH值至4.5左右时，8 株乳酸杆菌仍具有较快的产酸速率，后酸化水平均较差，其中菌株Z-7发酵终止时pH值为3.75，其余7 株菌株发酵终止时pH值在4.0左右，基本相同。因此从乳酸杆菌抑菌效果、凝乳状态及稳定性、产酸速率综合考虑，选择菌株Z-12、Z-38、Z-40、Z-46共4 株乳酸杆菌与嗜热链球菌ST-21进行组合，制备生物保鲜发酵剂。

2.3 生物保鲜发酵剂产酸性能测试结果

图 2 生物保鲜发酵剂产酸性能测试结果Fig. 2 Acid production ability of eight bio-preservative starter cultures

由图2可知，各发酵剂配方产酸趋势基本一致。配方3、7、8产酸速率最快，发酵5 h时pH值达到4.6左右；配方2产酸最慢，其他配方产酸速率一般，所有配方后酸化水平相对较好。因此，从产酸指标考虑，配方3、7、8适合生产风味发酵乳和乳酸菌饮料，但需同时考虑质构和感官特性，产酸快，后酸化平缓可缩短发酵时间，保持产品质量稳定。Fox等[17]研究表明，产酸过快易导致干酪凝块破碎，而产酸过慢则使凝块弹性不足，在上述发酵剂中配方2产酸最慢，但与李星科[18]、周海珍[19]等筛选干酪发酵剂的产酸速率基本一致，而且用于制作干酪的发酵剂主要为乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳脂明串珠菌等嗜温发酵剂，产酸速率一般，或嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌等嗜热发酵剂，产酸速率较快，但嗜热型干酪发酵剂主要为单菌种发酵[20-21]。此外，现代干酪生产主要采用混合菌种发酵，减少噬菌体危害程度[22]，且近年多以嗜热链球菌与中温菌混合发酵制备切达干酪[23]，因此从菌种组成和产酸性能分析，配方2可作为嗜温型干酪发酵剂。

2.4 生物保鲜发酵剂发酵乳质构测定结果

表 5 不同生物保鲜发酵剂发酵乳质构特性Table 5 Texture properties of yogurt fermented by eight different bio-preservative starter cultures

由表5可知，后熟48 h不同生物保鲜发酵剂发酵乳的质构不同。发酵乳硬度、稠度和黏聚性基本呈正向关，且与pH值有关[24]。配方7、8发酵乳在硬度、稠度和黏聚性方面突出主要与单菌株特异性有关，并且有研究表明，发酵乳黏稠度高适合生产乳酸菌饮料，可降低乳饮料离心沉淀率[25-26]。但陆延等[27]指出，发酵乳黏度越大，饮料稳定性越差，离心沉淀率越高，与上述理论和实际生产相矛盾，这可能是由于高黏度发酵剂产胞外多糖较多，与酪蛋白结合使饮料粒径增大，加快沉降速率，同时和仅添加大豆多糖并不适合构建杀菌型乳饮料稳定体系有关。配方2发酵乳的黏稠度小，有利于干酪中乳清的处理，适合用于干酪发酵剂[28]。此外其他配方质构差异无规律，可能与乳酸杆菌菌株特异性和接种量有关。乳酸杆菌接种量增加，共生作用使产酸加快，pH值降低，发酵乳硬度增加；但嗜热链球菌ST-21接种量降低，可能影响胞外多糖的产生，使发酵乳黏稠度下降[29]。

2.5 生物保鲜发酵剂发酵乳感官评价结果

由表6可知，发酵乳后熟48 h后在组织状态、风味和口感方面没有显著差异，表现均较好，其中配方3发酵乳风味较突出，配方7、8发酵乳在组织状态和口感方面表现较好，可能均与Z-38、Z-40菌株特异性有关，而配方2发酵乳在风味和口感上表现一般，可能与菌株Z-12蛋白水解能力有关。蛋白质水解是成熟干酪在后熟中风味和质构形成最重要的反应，由于干酪成熟期一般在6 个月以上，蛋白水解度大的菌株可能产生苦味多肽类物质，而由于风味发酵乳货架期较短，蛋白分解产生的短肽和氨基酸对产品流通期间的风味不易产生不良影响[30]，这可能也解释了配方3适宜制作风味发酵乳，配方2可用于制作干酪。

表 6 不同生物保鲜发酵剂发酵乳的感官评价Table 6 Sensory evaluation of yogurt fermented by eight different bio-preservative starter cultures

3 结 论

对15 株乳酸杆菌进行抑菌、凝乳、产酸实验，筛选得到Z-12、Z-38、Z-40和Z-46 4 株乳酸杆菌对单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌有明显抑制效果，且表现出良好的凝乳和产酸性能。将上述4 株乳酸杆菌分别与嗜热链球菌ST-21按不同比例组合制备生物保鲜发酵剂，测试发酵剂产酸和质构特性，并对发酵乳进行感官评价，其中发酵剂配方3在发酵5 h使发酵乳pH值降至4.6，后酸平缓，具有奶油香气，适用于生产风味发酵乳。用发酵剂配方7制备的发酵乳质构特性最好（硬度117.31 g、稠度2 846.18 g·s、黏聚性-77.87 g），适用于生产乳饮料。而用发酵剂配方2制备的发酵乳质构特性最小（硬度78.04 g，稠度1 562.67 g·s，黏聚性-28.31 g），适合生产干酪。