高效液相色谱法测定干酪和炼乳中糠醛类化合物含量

邢倩倩

（1.乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436；2.江南大学食品营养与安全协同创新中心，江苏 无锡 214122）

干酪是牛乳经凝乳并排出部分乳清而制成的新鲜或发酵成熟的产品，包括天然干酪和再制干酪两大类。干酪制备方法为：首先在凝乳酶或其他适当的凝乳剂作用下，使乳中1 种或几种原料的蛋白质凝固或部分凝固，排出凝块中的部分乳清；然后通过乳和（或）乳制品中蛋白质的凝固过程得到成品[1]。再制干酪起源于20世纪初期，通过使用1 种或2 种不同成熟度的天然干酪为主要原料，经切碎后添加乳化剂、稳定剂，融化制成。与天然干酪相比，再制干酪具有更高可融性、更长保质期及更低的贮藏条件要求等优势[2-3]。

炼乳主要包括淡炼乳、加糖炼乳和调制炼乳三大类，是以生乳或乳制品为原料，添加或不添加食品添加剂和营养强化剂，经加工制成的黏稠状产品。炼乳便于贮藏，营养价值高。炼乳生产工艺包括预热消毒、加糖、浓缩、冷却、加稳定剂、杀菌、密封[4-5]。

综上所述，干酪和炼乳均是以牛乳为主要原料，通过添加一些常用辅料，结合不同工艺所制得。添加不同辅料的牛乳热加工过程中，随着热处理温度的升高，乳清蛋白变性和凝集、乳糖异构化和降解、美拉德反应等理化反应会依次发生，会导致其中活性成分（如碱性磷酸酶和乳铁蛋白等）减少及化学反应产物（如乳果糖、糠氨酸和糠醛等）增加[6-12]。

美拉德反应又称“非酶褐变反应”，是在热（尤其是高温）加工富含还原糖食物过程中发生的一种反应[13-17]。美拉德反应在低温干燥和低温高湿的食品体系中反应速率缓慢，在高于35 ℃的中等湿度条件下，美拉德反应成为主要反应[18]。在乳制品热加工过程中，美拉德反应降低了键合到乳糖上的赖氨酸的可用性，进而导致了营养价值降低[19-20]。糠醛为美拉德反应中间阶段色素形成过程的产物。乳制品热加工过程中产生的糠醛类物质包含羟甲基糠醛、糠醛、呋喃甲基酮和甲基糠醛，结构如图1所示[21]。

图 1 乳制品中4 种糠醛类化合物结构式[21]Fig. 1 Chemical structure of four furfural compounds in dairy products[21]

在糠醛类化合物的药理研究方面，已有体外研究表明糠醛类物质具有遗传毒性、致突变和致癌等毒性[22-25]。欧盟食品安全委员会建议每人每天摄入的羟甲基糠醛含量上限为1.6 mg。近些年，在乳制品中的糠醛类化合物研究方面，Xing Qianqian等[26]建立高效液相色谱方法检测液态乳中的糠醛类化合物，曹庆等[27]研究不同贮藏条件下超高温灭菌咖啡牛乳中糠醛类化合物含量变化。现有的乳制品中糠醛类化合物含量检测的研究主要针对液态乳制品和乳粉[13,28-29]。

由于干酪和炼乳的配料和加工工艺均会促进糠醛类化合物的生成，针对再制干酪和炼乳中的糠醛类化合物的研究还很少。本研究针对干酪和炼乳中糠醛类化合物的提取方法开展研究，在建立合适的提取方法基础上对市面上常见品牌干酪和炼乳中的糠醛类化合物进行定量检测，对比不同干酪和不同炼乳中糠醛类化合物的含量，并对干酪、炼乳与常规液态乳制品中所含糠醛类化合物含量进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

某品牌再制干酪A、某品牌再制干酪B、某品牌干酪C、某品牌干酪D、某品牌再制干酪E、某品牌再制干酪F、某品牌加糖炼乳A、某品牌加糖炼乳B、某品牌加糖炼乳C、某品牌淡炼乳D、巴氏杀菌乳、超高温灭菌乳、低温酸乳、常温酸乳和褐变酸乳 上海某超市。

草酸二水合物（纯度99.5%～102.5%）、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯） 德国默克股份两合公司；三氯乙酸（纯度≥99.0%） 国药集团化学试剂有限公司；糠醛类化合物标准品：5-羟甲基糠醛（纯度98%）、2-糠醛（纯度99.5%）、2-呋喃甲基酮（纯度95.5%）和5-甲基糠醛（纯度99.6%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

PL2002电子天平、AL104电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SK5210HP超声清洗仪 上海科导超声仪器有限公司；DK-8B电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司；ZWY-2102C恒温培养振荡器上海智城分析仪器制造有限公司；Beckman Avanti J-30I落地式离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；1200高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；Milli-Q超纯水仪 默克化工技术（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取干酪，分别选取0.05、0.10、0.50 g 3 种称样量，加入12 mL超纯水，超声30 min后振荡20 min。

称取炼乳，分别选取0.02、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 g 7 种称样量，加入12 mL超纯水，超声30 min后振荡20 min。

称取巴氏杀菌乳、超高温灭菌乳、低温酸乳、常温酸乳和褐变酸乳15.00 g左右。

后续统一处理步骤为：加入5 mL当日配制0.15 mol/L草酸，100 ℃水浴加热25 min，冷却至室温；加入5 mL 40 g/100 mL三氯乙酸溶液，振荡10 min后，6 000 r/min离心15 min；取上清液倒入25 mL容量瓶，剩余固体加入5 mL 4 g/100 mL三氯乙酸溶液，振荡10 min后，6 000 r/min离心15 min；合并上清液，加入4 g/100 mL三氯乙酸溶液定容至刻度。然后量取适量上述样品溶液，过0.45 μm无机滤膜，进高效液相色谱仪分析。

1.3.2 高效液相色谱条件

色谱柱：Waters Atlantis T3柱（3.0 mm×15 cm，3 μm）；流动相：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～18.0 min、5%～65%流动相B，18.0～20.0 min、65%～95%流动相B，20.0～22.0 min、95%流动相B，22.0～22.1 min、95%～5%流动相B，22.1～30.0 min、5%流动相B；流速0.6 mL/min；色谱柱温度30 ℃；进样量5 μL；进样盘温度4 ℃；紫外检测波长280 nm。

结果计算及方法学参数测定结果参考文献[26]。

本研究干酪和炼乳样品中均检测到羟甲基糠醛和糠醛2 种糠醛类化合物，均未检测到呋喃甲基酮和甲基糠醛，因此本研究主要针对羟甲基糠醛和糠醛进行测定。

2 结果与分析

2.1 干酪中糠醛类化合物提取方法优化

表 1 不同称样量前处理后干酪A、B、C、D中糠醛类化合物含量比较Table 1 Furfural compounds contents in cheese A, B, C and Ddetermined after pretreatment with different sample amounts μg/100 g

由表1可知，对比不同称样量所得到的羟甲基糠醛和糠醛含量，0.05 g与0.10 g称样量下含量类似，称样量少更有利于样品分散提取，因此选定0.05 g作为干酪前处理的称样量[30]。

选取以上4 种干酪作为实验对象，开展回收率实验。选取0.05 g称样量，加入12 mL超纯水，加入1 mL标准品混合溶液（其中羟甲基糠醛质量浓度为20 μg/mL，糠醛质量浓度为1 μg/mL），采用本研究方法测定，并计算加标回收率。

表 2 干酪A、B、C、D中糠醛类化合物的加标回收率（n=3）Table 2 Recoveries of furfural compounds spiked into cheese A, B, C and D (n= 3)%

由表2可知，加标回收率为95%～105%，RSD为0.20%～2.00%，表明该方法的回收率良好，准确性高，可作为干酪中糠醛类化合物含量测定方法。

2.2 炼乳中糠醛类化合物提取方法优化

表 3 不同称样量前处理后炼乳A、B中糠醛类化合物含量比较Table 3 Furfural compounds contents in condensed milk A and B determined after pretreatment with different sample amounts μg/100 g

由表3可知，对比不同称样量所得到的羟甲基糠醛和糠醛含量，0.02 g与0.05 g称样量下糠醛类化合物峰面积相近，0.05 g称样量下炼乳B中糠醛类化合物含量较高，因此选定0.05 g作为炼乳前处理的称样量[30]。

选取以上2 种炼乳作为实验对象，开展回收率实验。选取0.05 g称样量，加入12 mL超纯水，加入1 mL标准品混合溶液（其中羟甲基糠醛质量浓度为20 μg/mL，糠醛质量浓度为1 μg/mL），采用本研究方法测定，并计算加标回收率。

表 4 炼乳A、B中糠醛类化合物的加标回收率（n=3）Table 4 Recoveries of furfural compounds spiked into condensed milk A and B (n= 3)%

由表4可知，加标回收率为95%～105%，RSD为0.40%～4.00%，表明该方法的回收率良好，准确性高，可作为炼乳中糠醛类化合物含量测定方法。

2.3 干酪和炼乳中糠醛类化合物含量测定结果

采用优化后的干酪和炼乳中糠醛类化合物提取方法，对市面上代表性干酪和炼乳中糠醛类化合物含量进行测定。蛋白质、糖和脂肪含量均为产品包装上所列值。由表5可知，选择6 种干酪进行糠醛类化合物含量测定，均检测到羟甲基糠醛和糠醛，未检测到呋喃甲基酮和甲基糠醛。6 种干酪中，A、B、E、F为再制干酪，C、D为干酪，4 种再制干酪中的羟甲基糠醛含量范围为10 000～22 000 μg/100 g，远高于2 种干酪中的羟甲基糠醛含量范围100～400 μg/100 g，4 种再制干酪中糠醛含量范围为75～180 μg/100 g，高于2 种干酪中的糠醛含量范围40～70 μg/100 g。由于再制干酪是由干酪添加白砂糖和其他成分，通过加热和持续搅拌而制成，热加工和糖的加入都会促进美拉德反应的进行，因此4 种再制干酪中的糠醛类化合物含量均明显高于干酪。选择4 种炼乳进行糠醛类化合物含量测定，均检测到羟甲基糠醛和糠醛，未检测到呋喃甲基酮和甲基糠醛。4 种炼乳中，A、B、C为加糖炼乳，含糖量均为60%左右，D为淡炼乳，含糖量为10%。3 种加糖炼乳中羟甲基糠醛含量范围为45 000～64 000 μg/100 g，远高于淡炼乳D中羟甲基糠醛含量392.24 μg/100 g；3 种加糖炼乳中糠醛含量范围为280～430 μg/100 g，高于淡炼乳D中糠醛含量77.66 μg/100 g。由于加糖炼乳中的糖含量比淡炼乳高50%，含糖量越高，美拉德反应速率越快，糠醛类化合物含量越高。

表 5 不同品类干酪和炼乳中糠醛类化合物含量Table 5 Furfural compounds contents in different brands of cheese and condensed milk

2.4 干酪和炼乳与常规乳制品中糠醛类化合物含量对比

表 6 干酪和炼乳与液态乳制品中糠醛类化合物含量比较Table 6 Furfural compounds contents in different brands of cheese,condensed milk and liquid milk products

选择市面上代表性品牌巴氏杀菌乳、超高温灭菌乳、低温酸乳、常温酸乳和褐变酸乳，采用本研究方法对其中的糠醛类化合物含量进行测定，并与干酪和炼乳中的糠醛类化合物含量进行对比。本方法可检测到巴氏杀菌乳、超高温灭菌乳、低温酸乳、常温酸乳和褐变酸乳中的羟甲基糠醛和糠醛，未检测到呋喃甲基酮和甲基糠醛。

由于蛋白质是乳制品最重要的组成部分，因此以羟甲基糠醛和糠醛含量和样品蛋白质含量计算得出样品每克蛋白质中羟甲基糠醛和糠醛含量。由表6可知，加糖炼乳C和再制干酪E中糠醛类化合物含量较高，常温酸乳和褐变酸乳次之，炼乳、低温酸乳、超高温灭菌乳和干酪中含量较低，巴氏杀菌乳最低。综上所述，使用蛋白质含量归一化后不同乳制品中的糠醛类化合物含量为加糖炼乳＞再制干酪＞褐变酸乳＞常温酸乳＞炼乳＞低温酸乳＞超高温灭菌乳＞干酪＞巴氏杀菌乳。

3 结 论

针对干酪和炼乳中的糠醛类化合物提取方式展开研究，称取0.05 g样品加12 mL超纯水超声30 min，该处理方式下加标回收率均可达到95%以上。通过优化提取方法结合高效液相色谱法检测市面上代表品牌干酪和炼乳中糠醛类化合物含量。结果表明：再制干酪A、B、E、F中的羟甲基糠醛、糠醛含量远高于干酪C、D，4 种再制干酪A、B、E、F中的糠醛含量高于干酪C、D；3 种加糖炼乳A、B、C中的羟甲基糠醛含量远高于淡炼乳D，3 种加糖炼乳A、B、C中的糠醛含量高于淡炼乳D。以上结果表明，干酪和炼乳中的糠醛类化合物与其相应的热处理过程和糖含量密切相关，可通过糠醛类化合物含量区别干酪和再制干酪，区别加糖炼乳和淡炼乳。最后对干酪、炼乳与液态乳制品中每克蛋白质所含糠醛类化合物含量进行对比，结果表明，加糖炼乳＞再制干酪＞褐变酸乳＞常温酸乳＞炼乳＞低温酸乳＞超高温灭菌乳＞干酪＞巴氏杀菌乳。