2号染色体单亲二体和STR基因座突变干扰亲子鉴定1例

李汶，廖怡，赵晓蒙，高伯迪，张前军，钟娟芳，杜娟，谭跃球，卢光琇

1.中南大学基础医学院生殖与干细胞工程研究所，湖南 长沙 410078；2.湖南省中信湘雅司法鉴定所，湖南 长沙410078

1 案 例

1.1 简要案情

因法定父亲怀疑孩子（3 岁男孩）非亲生，要求进行亲子鉴定。经被鉴定人知情同意后，采集法定父亲、孩子、母亲、外公和外婆的指尖血，根据《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T 383—2014）采用Chelex-100 法提取DNA。

1.2 检验过程

1.2.1 39 个常染色体及X 染色体STR（X-STR）基因座基因分型

对所提取的样本DNA 采用PowerPlex®21 系统（美国Promega 公司）和AmpFℓSTRTMIdentifilerTMPlus PCR 扩增试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司）在9700 型PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司）上共扩增20 个常染色体STR 基因座和Amelogenin基因座，对提取的样本DNA 采用Goldeneye®DNA 身份鉴定系统22NC［基点认知技术（北京）有限公司］扩增另外19 个常染色体STR 基因座。扩增产物在3130xl基因分析仪（美国Applied Biosystems 公司）上进行毛细管电泳，采用GeneMapperTMID-X软件（美国Applied Biosystems 公司）进行基因分型。

使用Investigator Argus X-12 QS 试剂盒（德国Qiagen 公司）对孩子及母亲的DNA 进行X-STR 基因座分型检测。

1.2.2 线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）高变区检测

使用表1 所列引物对孩子及母亲外周血样本DNA 进行mtDNA 高变区Ⅰ（hypervariable region Ⅰ，HVR-Ⅰ）、高变区Ⅱ（hypervariable region Ⅱ，HVR-Ⅱ）的扩增。扩增条件：95 ℃预变性40 s；94 ℃ 40 s，58 ℃40 s，72 ℃40 s，35 个循环。PCR 产物于3500xL基因分析仪（美国Applied Biosystems 公司）上进行Sanger 测序。根据《法医物证鉴定线粒体DNA 检验规范》（SF/Z JD0105008—2018），使用BLAST 在线软件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比较孩子及母亲的HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ序列，并将孩子和母亲的HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ序列分别与mtDNA 修正剑桥参考序列（revised cambridge reference sequence，rCRS）进行比较。

表1 mtDNA 高变区扩增引物Tab.1 Amplification primers of mtDNA HVR-Ⅰand HVR-Ⅱ

1.2.3 2 号染色体STR 基因座的检测

采用Primer-BLAST 在线工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）对2号染色体上15个STR 基因座进行PCR 引物设计（表2），其中正向引物进行荧光标记。

表2 增加的2 号染色体STR 基因座的PCR 引物序列Tab.2 PCR primer sequences of additional autosomal STR loci on chromosome 2

对法定父亲、孩子和母亲外周血DNA 进行PCR 扩增。扩增条件：95 ℃预变性90 s；94 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环。PCR 产物于3500xL 基因分析仪上进行毛细管电泳，对法定父亲、孩子和母亲进行STR 基因座分型检测。

1.3 检验结果

1.3.1 39 个常染色体和X-STR 基因座的检测结果

在法定父亲、孩子和母亲的39个常染色体STR 基因座中发现4个基因座不符合孟德尔遗传定律（表3），其中3 个位于2 号染色体上，1 个位于19 号染色体上。孩子在D2S1338、TPOX和D2S441基因座上的两个等位基因分型结果均与法定父亲一致，与母亲的等位基因分型均不一致。外公、外婆与孩子母亲在D2S1338、TPOX和D2S441基因座上的分型结果符合孟德尔遗传定律（图1）。

图1 3 个排除母子亲权关系的2 号染色体STR 基因座的基因图谱Fig.1 Gene mapping of the 3 STR loci on chromosome 2

表3 法定父亲、孩子和母亲39 个常染色体STR 基因座的基因型Tab.3 Genotype of the 39 autosomal STR loci in the alleged father，child and mother

X-STR 基因座分型结果提示孩子所有X-STR 基因座等位基因均能从母亲处找到来源，符合伴性遗传规律（表4）。

表4 孩子和母亲的X-STR 基因座的基因分型Tab.4 Genotype of X-STR loci of the child and mother

1.3.2 mtDNA 高变区序列分析结果

与mtDNA rCRS 进行比对分析，结果显示，孩子和母亲的mtDNA 高变区均存在11 个碱基的差异，但母子之间mtDNA 高变区序列一致（表5）。

表5 孩子和母亲的mtDNA 高变区序列与mtDNA rCRS 匹配分析结果Tab.5 Matching analysis between mtDNA hypervariable regions of the child and mother and mtDNA rCRS

1.3.3 增加的15 个2 号染色体STR 基因座分析及连锁分析结果

孩子在增加检测的15 个2 号染色体STR 基因座的2 个等位基因片段大小与法定父亲一致（表6）。综合之前试剂盒检测体系中3 个2 号染色体STR 基因座，以及增加的19 个2 号染色体STR 基因座的分析结果，所有2 号染色体STR 基因座的2 个等位基因均遗传自其法定父亲。

表6 法定父亲、孩子及母亲增加的2 号染色体STR 基因座的分析结果Tab.6 Analysis results of additional STR loci on chromosome 2 of the alleged father，child and mother（bp）

1.4 鉴定意见

依据现有资料和DNA 分析结果，支持法定父亲为孩子的生物学父亲。

2 讨论

在本例亲子鉴定案例中，法定父亲和孩子在法医实践中常规检测的39 个常染色体STR 基因座上均符合孟德尔遗传定律，而母亲与孩子在4个常染色体STR基因座上不符合孟德尔遗传定律，其中3 个在2 号染色体上、1 个在19 号染色体上，但母亲与孩子在12 个X-STR基因座上均符合遗传规律，且mtDNA HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ序列一致。经检测分析，4 个不符合孟德尔遗传定律母子亲权关系的遗传标记中，有3 个是由于父源2 号染色体单亲二体（uniparental disomy，UPD）所致，1 个是由于19 号染色体STR 基因座发生了一步突变所致。增加检测的15 个2 号染色体STR 基因座的分析结果支持这一结论。

UPD 是在减数分裂和（或）有丝分裂期间发生的两条同源染色体或部分染色体片段均来源于一个亲本的现象。自1980年首次被报道[1]后，1988年SPENCE等[2]报道了第1 例人类UPD。据报道[3]，人类UPD 的发生率约为1/3 500 活产儿。临床上，UPD 可导致印迹异常、常染色体隐性遗传病发生及体细胞嵌合体等，然而有些染色体（如1 号、2 号、6 号、16 号、21 号等）的UPD 并没有临床异常表现[4-7]，但可能会在检测的STR等遗传标记上表现为不符合孟德尔遗传定律，对亲子鉴定造成干扰。1988 年，BEIN 等[6]报道了第1 例因UPD 引起的错误排除的亲子鉴定案例。据文献[4-7]报道，目前已发现了5 条染色体的UPD 干扰亲子鉴定导致错误排除的现象，这些报道涉及整条2 号染色体UPD（UPD2）的有6 例[3，8-12]，包括2 例母源UPD2 和4 例父源UPD2，且均为同型UPD。而本例为异型的父源UPD2，可能是由于三体拯救导致，即2 号染色体二体精子与正常卵母细胞受精产生2 号染色体三体受精卵后丢失母源2 号染色体形成异型父源UPD2。同时本例证实了2 号染色体上很少或没有父系印迹基因。

STR 基因座等位基因突变较为罕见，通常男性突变率（2‰）高于女性（1‰～0.5‰）[13]，STR 基因座的突变会严重干扰亲子鉴定。本例还涉及D19S253基因座发生了一步突变。D19S253基因座突变较为罕见，在葡萄牙白人、巴西人中突变率分别为3.89×10-3、3.07×10-3[14-15]，此前文献报道中国汉族人群中该基因座没有发现突变[16-17]。

综上所述，UPD 和基因突变都会影响亲子鉴定结果的判断，尤其是UPD 和突变同时发生时，可能导致错误的鉴定意见。因此，当父亲、母亲和孩子之间不符合孟德尔遗传定律的STR 基因座集中在单条或两条染色体上时，应谨慎解释亲子关系检验结果。