莪术醇通过上调miR-214抑制TGF-β诱导的RL-95细胞生长及纤维化相关蛋白表达*

田滢舟， 陈思达， 梁雪芳， 曹立幸， 具春花， 陈 颐

（广州中医药大学第二附属医院妇科，广东广州510120）

子宫内膜异位症是一种常见的良性、雌激素依赖性妇科疾病，以子宫内膜腺体和间质异位至卵巢或盆腔内其它部位生长为特征。在雌激素作用下，异位内膜发生周期性脱落、增生和纤维化，导致瘢痕化和组织功能改变，是不孕和疼痛的主要原因［1］。育龄女性子宫内膜异位症患病率高达10%，严重影响女性生活质量和生命健康［2］。莪术醇（curcumol）是从姜科植物莪术挥发油中分离的双环倍半萜类成分，具有显著的抗肿瘤作用。研究表明，莪术醇可能通过抑制腹腔微环境中炎症反应而减轻实验性大鼠子宫内膜异位症［3］。此外，莪术醇通过靶向抑制肝星状细胞活化、迁移和黏附而具有抗纤维化作用［4］。然而，莪术醇对子宫内膜异位症纤维化的影响尚不清楚。微小RNA（mi⁃croRNA，miRNA，miR）是一种短链非编码RNA，通过抑制翻译或降解靶mRNA 调控基因表达参与各种生物过程，是机体发育和细胞稳态的重要调节剂，异常表达的miRNA 已被证实与包括子宫内膜异位症在内的多种人类疾病有关［5-6］。研究显示，子宫内膜异位症中纤维化标志物表达上调与miR-214 表达下调相关，子宫内膜间质细胞来源的外泌体miR-214 可抑制子宫内膜异位症纤维化［7］。转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是纤维化过程中的关键分子，本研究以TGF-β 诱导子宫内膜癌RL-95 细胞建立子宫内膜异位症细胞模型［8］，探讨miR-214 在莪术醇抗子宫内膜异位症纤维化形成中的作用，以期为子宫内膜异位症纤维化的治疗提供有效策略。

材料和方法

1 细胞和主要试剂

RL-95 细胞购于中国典型培养物保藏中心。TGF-β 购自大连美仑生物技术有限公司；莪术醇（纯度≥98%）购于上海紫一试剂厂；miRNA 逆转录试剂盒和miRNA 检测试剂盒购于北京天根生化科技研究所；细胞计数试剂盒（CCK-8）和细胞周期检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；抗兔源α-平滑肌肌动蛋白（α-mooth muscle actin，α-SMA）单克隆抗体、抗鼠源I 型胶原（collagen type I，Col I）单克隆抗体、抗兔源磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体、羊抗兔IgG 和羊抗鼠IgG 购自北京博奥森生物技术有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养和子宫内膜异位症细胞模型的构建 RL-95 细胞采用含5 μg/L TGF-β、10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM/F12 培养液在5% CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养。

2.2 实验分组和细胞处理 实验分为对照（control）组（不做处理）、TGF-β 组（用含5 μg/L TGF-β 的培养液孵育细胞24 h）、TGF-β+低剂量莪术醇组（用含5 μg/L TGF-β 和7.5 mg/L 莪术醇的培养液孵育细胞24 h）、TGF-β+中剂量莪术醇组（用含5 μg/L TGF-β和15 mg/L 莪术醇的培养液孵育细胞24 h）、TGF-β+高剂量莪术醇组（用含5 μg/L TGF-β 和30 mg/L 莪术醇的培养液孵育细胞24 h）、TGF-β+高剂量莪术醇+anti-miR-NC 组（转染anti-miR-NC 的细胞用含5 μg/L TGF-β 和30 mg/L 莪术醇的培养液孵育24 h）和TGFβ+高剂量莪术醇+anti-miR-214组（转染anti-miR-214的细胞用含5 μg/L TGF-β 和30 mg/L 莪术醇的培养液孵育24 h）。细胞转染严格遵照Lipfectamine 2000说明书进行。

2.3 CCK-8法检测细胞活力 将各组RL-95细胞接种于96 孔板，贴壁后每孔添加CCK-8 溶液10 μL，继续培养2 h，酶标仪在450 nm处测量吸光度（A）值。

2.4 流式细胞术检测细胞周期分布 收集各组细胞，磷酸盐缓冲液洗涤后，75%乙醇固定，用50 mg/L碘化丙啶溶液（含RNase）孵育细胞30 min，然后用流式细胞仪分析G0/G1、S和G2/M期细胞比例。

2.5 RT-qPCR 检测miR-214 的表达 使用Trizol 试剂从各组细胞中提取总RNA，用miRNA 逆转录试剂盒将1 μg 总RNA 逆转为cDNA，用miRNA 检测试剂盒进行实时荧光定量PCR。miR-214 相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算。miR-214 的上游引物序列为5'-TATACATCAAACAGCAGGCACA-3'，下游引物序列为5'-CATTCGATCTTCTCCACAGTCTC-3'；内参照U6的上游引物序列为5'-GCTTCGGCAGCACATATAC⁃TAAAAT-3'，下游引物序列为5'-CGCTTCAC⁃GAATTTGCGTGTCAT-3'。

2.6 Western blot 法检测纤维化相关蛋白的表达细胞收获后用冷冻RIPA 裂解缓冲液裂解，试剂盒检测蛋白浓度。取30 μg 蛋白样品经SDS-PAGE 分离后转移至聚偏二氟乙烯膜。室温下用5%脱脂奶粉封闭膜1 h，然后4℃下孵育Ⅰ抗（抗α-SMA 抗体、抗Col I 抗体和抗GAPDH 抗体）过夜，随后室温下进一步孵育Ⅱ抗2 h。滴加增强型化学发光检测试剂暗室显色曝光，Quantity One 软件分析目的蛋白相对表达水平（目的蛋白带灰度与GAPDH 蛋白带灰度的比值）。

3 统计学处理

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。实验独立重复3 次，数据以均数±标准差（mean±SD）表示。采用独立样本t检验比较两组间差异；采用单因素方差分析比较多组间差异，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 莪术醇对TGF-β 诱导的RL-95 细胞活力和细胞周期的影响

与control 组比较，TGF-β 组G0/G1期细胞比例显著降低，细胞活力和S 期细胞比例显著升高（P＜0.05）；与TGF-β组比较，TGF-β+莪术醇（15 mg/L）组和TGF-β+莪术醇（30 mg/L）组G0/G1期细胞比例显著升高，细胞活力和S 期细胞比例显著降低（P＜0.05）；TGF-β+莪术醇（7.5 mg/L）、TGF-β+莪术醇（15 mg/L）和TGF-β+莪术醇（30 mg/L）三组间G0/G1期细胞比例、S期细胞比例和细胞活力的差异亦有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 莪术醇对TGF-β诱导RL-95细胞活力和细胞周期的影响Table 1. The effects of curcumol on the viability and cell cycle of RL-95 cells induced by TGF-β（Mean±SD. n=3）

2 莪术醇对TGF-β 诱导的RL-95 细胞中纤维化相关蛋白及miR-214表达的影响

与control 组比较，TGF-β 组RL-95 细胞miR-214表达显著降低，而α-SMA 和Col I 蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与TGF-β 组比较，TGF-β+莪术醇（15 mg/L）组和TGF-β+莪术醇（30 mg/L）组RL-95 细胞miR-214 表达显著升高，α-SMA 和Col I 蛋白表达显著降低（P＜0.05）；TGF-β+莪术醇（7.5 mg/L）和TGF-β+莪术醇（15 mg/L）和TGF-β+莪术醇（30 mg/L）三组间miR-214 表达及α-SMA 和Col I 蛋白表达的差异亦有统计学意义（P＜0.05），见表2、图1。

3 敲减miR-214 表达可逆转莪术醇对TGF-β 诱导的RL-95细胞活力和细胞周期分布的影响

与TGF-β+莪术醇（30 mg/L）+anti-miR-NC 组比较，TGF-β+莪术醇（30 mg/L）+anti-miR-214 组RL-95细胞miR-214 表达量和G0/G1期细胞比例显著降低，细胞活力和S 期细胞比例显著升高（P＜0.05），见表3。

4 敲减miR-214 表达可逆转莪术醇对TGF-β 诱导RL-95纤维化相关蛋白表达的影响

与TGF-β+莪术醇（30 mg/L）+anti-miR-NC 组比较，TGF-β+莪术醇（30 mg/L）+anti-miR-214 组RL-95细胞α-SMA 和Col I 蛋白表达显著升高（P＜0.05），见图2。

表2 莪术醇对TGF-β诱导的RL-95细胞中纤维化相关蛋白及miR-214表达的影响Table 2. Effect of curcumol on TGF-β-induced expression of fibrosis-related proteins and miR-214 in RL-95 cells（Mean±SD. n=3）

Figure 1. The effect of curcumol on TGF-β-induced fibrosis-related protein expression in RL-95 cells.图1 莪术醇对TGF-β诱导的RL-95细胞中纤维化相关蛋白表达的影响

表3 敲减miR-214表达可逆转莪术醇对TGF-β诱导的RL-95细胞活力和细胞周期分布的影响Table 3. Knock-down of miR-214 expression reversed the effect of curcumol on the viability and cell cycle distribution of RL-95 cells induced by TGF-β（Mean±SD. n=3）

Figure 2. Knock-down of miR-214 reversed the effect of curcumol on TGF-β-induced fibrosis-related protein expression in RL-95 cells. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs TGF-β+curcumol（30 mg/L）+anti-miR-NC group.图2 敲减miR-214可逆转莪术醇对TGF-β诱导的RL-95细胞纤维化相关蛋白表达的影响

讨 论

子宫内膜异位症虽为良性疾病，但其生长特性与恶性肿瘤的恶性生物学行为类似，因此具有抗肿瘤作用的中药单体可能对子宫内膜异位症具有防治作用。莪术醇是莪术挥发油的主要单体成分，通过促凋亡、抗增殖和免疫增强等机制而具有广泛的抗肿瘤作用。研究显示，莪术醇可诱导结肠癌细胞活性氧产生，阻断蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/糖原 合酶 激 酶3β（glycogen synthase ki⁃nase 3β，GSK3β）/细胞周期素D1（cyclin D1）途径诱导G0/G1周期阻滞［9］。莪术醇通过调节E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白表达减弱而诱导TGF-β1 介导的鼻咽癌细胞上皮-间充质转化［10］。莪术醇还显著降低子宫腺肌症异位子宫内膜间质细胞的增殖和迁移能力，诱导细胞凋亡［11］。此外，莪术醇还诱导肝星状细胞凋亡，抑制血管生成，逆转早期和晚期肝纤维化［12-13］。然而，莪术醇在子宫内膜异位症纤维化中的作用并不清楚。本研究以TGF-β 诱导RL-95 细胞模拟子宫内膜异位症纤维化，发现细胞活力、S 期细胞比例以及纤维化标志蛋白α-SMA 和Col I 表达显著增加，G0/G1细胞比例显著升高，而莪术醇以剂量依赖方式降低细胞活力和S 期细胞比例，升高G0/G1期细胞比例，抑制α-SMA 和Col I 蛋白表达。与本研究类似，Sun 等［14］的研究发现，莪术醇可抑制TGF-β1 诱导的人肺成纤维细胞增殖，降低α-SMA 表达水平，降低细胞中的Col I 沉积。以上研究表明，莪术醇可抑制TGF-β 诱导的RL-95 细胞生长及纤维化蛋白表达，具有潜在的对抗子宫内膜异位症纤维化作用。

miRNA 通过调控细胞生长、迁移、凋亡和耐药，在人类健康和疾病中发挥重要作用［15-16］。还有研究报道，莪术醇可通过诱导miR-152-3p 表达而抑制恶性黑色素瘤B16 细胞增殖、侵袭、转移和上皮-间充质转化［17］。miR-214 是一种纤维化相关miRNA，在缺氧诱导的大鼠急性肾损伤模型中miR-214 表达降低，过表达miR-214 可抑制细胞凋亡和纤维化，改善急性肾损伤［18］。miR-214 是心脏成纤维细胞增殖、活化以及心脏纤维化的重要调节剂［19］。沉默长链非编码RNA KCNQ1 重叠转录物1（KCNQ1 overlap⁃ping transcript 1，KCNQ1OT1）可通过上调miR-214减轻糖尿病心肌病的纤维化和焦磷酸化，改善C57BL/6 小鼠心脏功能［20］。此外，miR-214 可靶向结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF/CCN2），从而对子宫内膜异位症纤维化具有抑制作用［8］。本研究发现，莪术醇干预后miR-214表达以剂量依赖方式增加，提示莪术醇的抗子宫内膜异位症纤维化作用可能与miR-214 水平升高有关。进一步的敲减实验结果显示，转染miR-214 抑制剂下调miR-214 表达可降低高剂量莪术醇对TGF-β1 诱导的RL-95 细胞活力、细胞周期分布以及α-SMA 和Col I 蛋白表达的影响。以上结果表明，莪术醇至少部分通过上调miR-214 表达而抑制TGF-β诱导的RL-95 细胞生长和纤维化。然而，miR-214下游靶基因众多，探索其下游靶基因是下一步研究的重点。

综上所述，本研究证实莪术醇可通过上调miR-214 抑制TGF-β 诱导的RL-95 细胞生长和纤维化相关蛋白表达，进而对子宫内膜异位症纤维化具有潜在的治疗作用。