apo A1和apo B侯选参考方法在室间质量评价中的应用价值

李 卿，居 漪，唐丽萍，金中淦，孙贺伟

（上海市临床检验中心，上海 200126）

载脂蛋白（apolipoprotein，apo） B是致动脉粥样硬化性脂蛋白的成分之一，其含量可体现低密度脂蛋白的颗粒数，尤其在评价伴有代谢综合征和糖尿病的动脉粥样硬化性心血管疾病时有重要的临床意义[1]。apo A1作为抗动脉粥样硬化的标志物，与apo B的比值可用于特定人群的风险评估和临床决策[2]。

目前，apo A1和apo B的检测主要采用免疫透射比浊法（immunoturbidimetry，ITA）。试剂盒中的抗体对apo抗原亲和力的差异、抗原决定簇的异质性、apoA-I和apoB在不同脂蛋白中的结构等因素，造成不同品牌试剂盒检测结果存在差异。实验室在采用质谱技术对人血清apo进行绝对定量方面已经积累了一定的经验[3-4]。apo A1和apo B的质谱定量方法一般为同位素稀释液相色谱串联质谱（isotope dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry，ID-LC-MS）技术，即采用同位素标记多肽，结合可溯源的血清校准品，对apo A1和apo B进行绝对定量[5]。目前尚未见ID-LC-MS/MS技术应用于apo A1和apo B室间质量评价（external quality assessment，EQA）的报道。本研究在前期建立相关技术平台的基础上，结合EQA结果，探讨ID-LC-MS/MS赋值作为EQA靶值的应用潜力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血清样本 血清样本质谱法定量所使用的校准品为人血清制品，由荷兰莱顿大学医学中心提供；apo A1和apo B由美国西北脂类代谢和糖尿病研究实验室赋值，分别溯源至世界卫生组织参考物质SP1-01和SP3-08；5份EQA样本为人血清制品（编号分别为EQA1、EQA2、EQA3、EQA4和EQA5），购自上海伊华医学科技有限公司，用于上海市临床检验中心组织的2017年EQA活动。样本经过均匀性和稳定性检验，符合要求。

1.1.2 同位素标记物质和试剂 合成肽段VQPYLDDFQK和肽段TEVIPPLIENR中的亮氨酸（L）为同位素标记的氨基酸（13C15N）[吉尔生化（上海）有限公司]，二硫键还原剂三膦盐酸盐（美国Thermo Fisher公司），碘乙酰胺、脱氧胆酸钠、Tris缓冲液、甲醇、甲酸（美国Sigma-Aldrich公司），Promega胰蛋白酶（测序级，上海普洛麦格生物产品有限公司）。

1.1.3 仪器 Agilent 1290 超高效液相系统（美国Agilent公司），AB5500 QTRAP三重串联四级杆质谱仪（美国AB Sciex公司）。称量使用赛多利斯型分析天平（美国Sartorius公司）。色谱柱使用Zorbax eclipse SB-C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm，美国Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 目标肽选择 定量肽段用于定量apo A1和apo B的绝对含量。定性肽段用于确认和排除干扰。肽段选择见表1。

表1 apo A1和apo B的肽段及母离子/子离子对

1.2.2 样本前处理 用胰蛋白酶酶解5份人血清EQA样本，所有的溶液均为新鲜配制，按照文献[6]进行操作。（1）变性：样本20倍稀释后，使用0.523%脱氧胆酸钠Tris溶液增溶，加入还原剂三膦盐酸盐，使其在反应体系中的终浓度为0.46%，56 °C 变性30 min，打开二硫键。（2）烷基化：取出变性样本放置于室温冷却。每支样本加入4.6 mmol/L碘乙酰胺20 μL，室温避光放置30 min。（3）酶解：每支样本加入胰蛋白酶酶液24 μL，37 ℃酶解3 h，加入终止液（4.7%甲醇和0.6%甲酸的水溶液）终止。

1.2.3 ID-LC-MS/MS分析 （1）液相色谱部分。流动相A为5%甲醇和0.05%甲酸水溶液，流动相B为95%甲醇和0.05%甲酸水溶液，流速为0.3 mL/min。洗脱梯度：流动相B为0.0～6.0 min 15%～85%；6.0～8.0 min 85%；8.0～8.1 min 85%～100%；8.1～10.0 min 100%；10.1～15.0 min 100%～15%。（2）质谱部分。使用正离子模式和多反应监测方法，母离子/子离子对的选择见表1。

1.2.4 ITA分析 EQA参加者按照试剂盒说明书进行操作，采用ITA分析5份EQA样本。

1.3 统计学方法

建立ID-LC-MS/MS校准方程，以待测样品的未标记定量肽和同位素标记定量肽的比值为自变量，通过校准方程计算含量并进行校准。使用统计软件JMP 13.2绘制箱线图。采用Minitab 18.0软件进行Deming回归分析。

2 结果

2.1 EQA结果

共有340家实验室使用ITA检测，apo A1和apo B的EQA结果见表2。

表2 apo A1和apo B的EQA结果

2.2 ID-LC-MS/MS检测结果

ID-LC-MS/MS检测结果为重复检测3次得到的均值。apo A1项目EQA1、EQA2、EQA3、EQA4、EQA5的定量检测结果分别为2.36、1.71、2.52、0.86和1.47 g/L；apo B项目EQA1、EQA2、EQA3、EQA4、EQA5的定量检测结果分别为1.36、1.07、1.50、0.57和0.84 g/L。

2.3 ID-LC-MS/MS检测结果与EQA结果的比较

apo A1项目，EQA2、EQA3、EQA4 IDLC-MS/MS的结果均低于ITA的中位数，EQA1和EQA5 ID-LC-MS/MS的结果高于ITA的中位数；apo B项目，除EQA4外，其他样本IDLC-MS/MS的结果均低于ITA的中位数；见图1。考虑到ID-LC-MS/MS和ITA的误差，采用Deming回归分析，结果显示apo A1项目斜率的95%可信区间为0.977～0.992，截距的95%可信区间为0.008～0.035；apo B项目斜率的95%可信区间为0.828～1.054，截距的95%可信区间为-0.122～0.144。见图2。

图1 ID-LC-MS/MS检测结果和EQA结果箱线图

图2 Deming回归分析结果

3 讨论

目前正在运行的apo标准化体系使用的参考物质包括世界卫生组织参考物质，编号分别是SP1-01和SP3-08，此二级参考物质由国际临床化学与检验医学联合会的apo标准化工作组研制，由该工作组的组织方——美国西北脂类代谢和糖尿病研究实验室赋值，采用免疫法测定。定值所使用的一级参考物质包括BCR-CRM393（纯化apo A1）和密度为1.03～1.05的超速离心纯化的低密度脂蛋白（用于apo B）。但是免疫法作为参考方法可能会受交叉反应、自身抗体[7]、亲和力减弱、抗原表位变性等因素干扰。近年来，有学者尝试使用质谱来更准确地测定apo A1和apo B[8-9]，其中Cobbaert教授团队建立的质谱定量方法最为成熟[5]，是国际临床化学与检验医学联合会apo质谱检测工作组的指定检测方法。

ID-LC-MS/MS是对靶向蛋白质绝对定量的重要方法，其将稳定同位素标记的内标肽加入到胰酶酶切产生的多肽中，由于内标肽和内源性肽具有相同的序列，因此具有相同的液相色谱保留时间、质谱离子化效率和碎裂模式。通过比较两者子离子信号强度，可计算出目标蛋白质的量。基于ID-LC-MS的apo参考方法和标准化研究是近年来的研究热点，但尚未见将该技术应用于EQA样本定值和评价的研究报道。

对于定义分析质量，2014年米兰战略会议提出了3个模型，即基于检测性能对临床结果影响的模型1、基于被测量生物变异的模型2和基于现有最高技术水平的模型3[10-11]。《中国成人血脂异常防治指南（2016年修订版）》（简称指南）对apo A1和apo B的偏移规定为靶值±5%[12]，该指南明确说明“靶值一般指参考（标准）物质定值或参考方法测定值”。因此，当以靶值±5%作为判断标准时，所有参与者检测5个EQA样本的平均合格率分别为61.5%（apo A1）和41.0%（apo B）。从最新的生物变异数据库中计算偏移[13]，得出apo A1的最低偏移要求为4.6%（适中为3.0%，最优为1.5%），与指南规定的5%接近；而apo B的最低偏移要求为8.1%（适中为5.4%，最优为2.7%），比指南规定的5%要求更松，此时所有参与者检测5个EQA样本的平均合格率上升至61.8%。值得注意的是，WS/T 403—2012《临床生物化学检验常规项目分析质量指标》指出，中等和低等偏移造成错误诊断的发生率分别为14%和32%，但apo A1和apo B的偏移与错误诊断发生率仍需进一步研究。若采用美国病理学家协会使用的标准，即靶值±15%，所有参与者检测5个EQA样本的平均合格率分别为95.1%（apo A1）和89.7%（apo B）。

综上所述，在需要使用靶值评价的临床指南或者EQA工作中，基于ID-LC-MS/MS的候选参考方法具有一定的应用潜力。