血培养瓶增菌法快速鉴定和快速药物敏感性试验可行性分析

乔玉莉，黄宗帅，田月如，关 明，蒋晓飞

（1. 普洱市人民医院检验科，云南 普洱 665000；2. 湘雅常德医院，湖南 常德 415000；3. 复旦大学附属华山医院，上海 200040）

随着抗菌药物、免疫抑制剂的广泛应用及侵入性医疗操作的开展，颅内感染成为神经外科患者治疗过程中最严重的并发症，其致残率和致死率较高，治疗难度较大。常规脑脊液培养是将脑脊液浓缩集菌后培养，获取单个菌落后再进行鉴定和药物敏感性分析，耗时，且阳性率低，无法满足临床抗感染治疗需求。张瞿璐等[1]发现，采用血培养瓶进行脑脊液培养能提高脑脊液培养阳性率，缩短培养时间。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）可直接鉴定血培养阳性样本[2-3]及中段尿[4-5]、无菌体液[6]等临床样本中的病原微生物。基于此，我们开发了“直接将脑脊液注入血培养瓶进行增菌培养，报阳后直接离心富集细菌，采用MALDI-TOF MS快速鉴定，并直接进行体外药物敏感性试验”的快速脑脊液培养细菌鉴定和药物敏感性试验的方法，并与常规的脑脊液浓缩集菌后培养，获取菌落后再进行鉴定和药物敏感性分析进行比较，不一致的鉴定结果以测序结果为参考，评估快速鉴定和快速体外药物敏感性试验方法的可行性与临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集2018年12月—2019年7月华山医院检验科送检的1 446例脑脊液样本，随机抽取345例按血培养瓶增菌法进行培养，报阳后，分别采用BD凝胶分离血清管直接离心集菌（快速法）富集细菌和常规转种培养（常规法）获取纯细菌，革兰阴性菌及革兰阳性菌同时采用纸片扩散法、微量肉汤稀释法和Vitek 2 Compact自动化鉴定药敏仪（仪器法）进行体外药物敏感性试验，隐球菌采用ATB FUNGUS2药物敏感性试验纸条进行体外药物敏感性试验；其他1 101例采用常规浓缩集菌培养法进行培养，有细菌生长的样本通过常规转种获取纯细菌后进行鉴定。

1.2 仪器与试剂

Micro flex LT型MALDI-TOF MS仪、MSP 96孔靶板、IVD细菌测试标准品和α-氰基-4-羟基肉桂酸基质均购自德国Bruker Daltonik公司，BACTECTMFX血培养系统、需氧血培养瓶、厌氧血培养瓶及真菌/分枝杆菌血培养瓶、BD凝胶分离血清管（SST管3.5 mL）均购自美国BD公司，BacT/Alert 3D、Vitek 2 Compact自动化鉴定药敏仪、需氧血培养瓶、厌氧血培养瓶、AST-P639鉴定卡、AST-N335鉴定卡、酵母样真菌药敏试剂盒均购自法国生物梅里埃公司。血平板、巧克力平板及中国蓝平板均购自上海科玛嘉公司，葡萄球菌药敏板、肠杆菌科药敏板均购自温州康泰公司，甲酸购自美国Sigma Aldrich公司。

1.3 方法

1.3.1 镜检 挑取血培养仪中报阳的脑脊液血培养瓶中菌落，涂片并革兰染色，显微镜下观察结果，并记录。

1.3.2 MALDI-TOF MS鉴定 脑脊液快速鉴定方法参考AZRAD等[7]的改良方法，并稍作修改：从每个阳性血培养瓶中转移5 mL到血清分离胶管，1 237×g离心10 min，弃上清。取出沉淀物并置于1.5 mL Eppendorf管中，17 949×g离心1 min，弃上清。用无菌去离子水洗2遍。取1 μL沉淀置于MSP 96孔靶板上，各靶点覆盖1 μL 70%的甲酸，干燥后，再加入1 μL α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液，采用Microflex LT系统和MALDI BIOTYPER 3.0软件进行质谱分析。纯培养物是由阳性血培养瓶转种至血平板，培养过夜后挑取的单个菌落，将其均匀涂抹在MSP 96孔靶板上，进行MALDI-TOF MS分析。根据STEVENSON等[8]提出的判断标准，结合文献[4，9-10]，每个样本点样4次，当至少有2次结果一致，且第1个鉴定分数≥1.4时，判定为鉴定准确。

1.3.3 快速和常规体外药物敏感性试验 快速药物敏感性试验直接取上述细菌沉淀物，常规药物敏感性试验取血培养阳性转种至血平板上的菌落，分别配制成0.5麦氏浊度菌悬液，分别采用纸片扩散法、微量肉汤稀释法和仪器法进行药物敏感性试验。隐球菌快速和常规药物敏感性试验板严格按照酵母样真菌药敏试剂盒说明书要求，采用显色微量肉汤稀释法检测入组菌株5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。质控菌株为大肠埃希菌（ATCC 25922）、大肠埃希菌（ATCC 35218）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、粪肠球菌（ATCC 29212），购自国家卫生健康委临床检验中心。

结果判读和数据分析按照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2018年版标准，替考拉宁参考CLSI 2016年版标准，替加环素参照欧州药敏试验委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）2012版标准。一致率参照CLSI商品化微生物鉴定及药物敏感性试验系统相关指南要求。

1.4 统计学方法

采用 SPSS 17.0软件及WHONET 5.6软件进行统计分析。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑脊液血培养瓶增菌法与常规浓缩集菌培养法报阳时间及阳性率的比较

脑脊液血培养瓶增菌培养法与常规浓缩集菌培养法的阳性率分别是13.91%（48/345）和2.91%（32/1 101），差异有统计学意义（χ2=60.889，P=0.000）。脑脊液样本血培养瓶增菌法临床常见细菌的平均报阳时间是（1.95±0.77）d，而常规浓缩集菌培养临床常见细菌的平均检出时间为（1.67±0.41）d，差异无统计学意义（t=-1.605，P=0.119）；2种方法检出真菌的时间分别为（2.16±0.60）和（3.9 2±1.0 8）d，差异有统计学意义（t=-3.497，P=0.002）。血培养瓶增菌法报阳细菌中革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌、革兰阳性杆菌及真菌分布情况分别为16.33%（8/49）、34.69（17/49）、10.20%（5/49）及38.78%（19/49），常规浓缩集菌培养法分别为43.75%（14/32）、34.38%（11/32）、6.24%（2/32）及15.63%（5/32），差异有统计学意义（χ2=9.212，P=0.027）。

2.2 脑脊液血培养瓶增菌法阳性样本快速法与常规法鉴定结果的比较

采用常规转种方法从48份脑脊液血培养瓶增菌法阳性样本中分离鉴定出49株细菌，而采用快速法鉴定出44株细菌，快速法未能鉴定出的5株细菌来自4例样本，分别是：混合感染1例、阳性球菌2例和真菌1例，符合率为89.80%，见表1。快速法鉴定出7株革兰阴性菌（混合感染未鉴定出）和5株革兰阳性杆菌，与常规法鉴定结果相符。常规法鉴定的17株革兰阳性球菌中，快速法鉴定出12株葡萄球菌（包含1株厌氧的解糖葡萄球菌）、2株藤黄微球菌、1株葡萄球菌和1株链球菌（鉴定到属），另外1株细菌因混合感染而未鉴定出，此3株未纳入快速法鉴定的阳性率计算中，但鉴定到属的样本仍旧做了快速药物敏感性试验。常规法鉴定的19株真菌中，快速法鉴定出15株新型隐球菌、2株念珠菌和1株皮炎外瓶霉，有1株革兰染色似隐球菌，常规法鉴定到属、快速法未鉴定出，后经测序验证为新型隐球菌。2种方法鉴定结果比较，差异无统计学意义（χ2=0.116，P=0.990）。

表1 快速法与常规法鉴定结果比较

2.3 脑脊液血培养瓶增菌法阳性样本快速法与常规法药物敏感性试验结果比较

2.3.1 脑脊液血培养瓶增菌法阳性样本革兰阴性菌快速法与常规法药物敏感性试验结果比较 快速法鉴定出7株革兰阴性菌，混合感染未鉴定出，无法比较药物敏感性试验结果；另外1株嗜麦芽窄食假单胞菌无相应药敏卡，未使用仪器法进行药物敏感性试验，未统计；纸片扩散法和微量肉汤稀释法只选择左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑、米诺环素和头孢他啶-他唑巴坦4种抗菌药物。3种药物敏感性试验方法中仅有微量肉汤稀释法的替加环素分类一致率为83.33%（5/6），其他抗菌药物分类一致率均为100%。

2.3.2 脑脊液血培养瓶增菌法阳性样本革兰阳性球菌快速与常规药物敏感性试验结果比较 革兰阳性球菌的3种药物敏感性试验中，纸片扩散法红霉素分类一致率为84.62%（11/13），微量肉汤稀释法红霉素和庆大霉素分别为84.62%（11/13）和91.67%（11/12）；仪器法克林霉素和庆大霉素分类一致率均为91.67%（11/12），其他抗菌药物（阿米卡星、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、亚胺培南、美罗培南、米诺环素、头孢他啶-他唑巴坦、复方磺胺甲噁唑、替加环素）快速法和常规法药物敏感性试验结果完全一致。

2.3.3 脑脊液血培养瓶增菌法阳性样本隐球菌快速法与常规法药物敏感性试验结果准确率 快速法鉴定出15株新型隐球菌，1株革兰染色似隐球菌，但未鉴定出结果，常规应鉴定到属，后经测序验证为新型隐球菌，也纳入隐球菌分别进行快速法与常规法药物敏感性试验。2种药物敏感性试验结果完全一致。

2.3.4 脑脊液血培养瓶增菌法阳性样本标准一致性比较 以纯培养微量肉汤稀释法为标准，快速微量肉汤稀释法和快速仪器法的标准一致率分别为98.56%（273/277）和97.83%（271/277），快速微量肉汤稀释法的微小错误率分别为1.44%（4/277），快速仪器法的错误率为2.17%（6/277），见表2。

表2 脑脊液血培养瓶增菌法阳性样本快速法药物敏感性试验的标准一致率 株（%）

3 讨论

MALDI-TOF MS相对于传统细菌培养鉴定，可以更快速、准确地鉴定出血培养阳性样本中的细菌，缩短血培养报告结果的时间，为临床提供更为及时、准确的用药指导。由于脑脊液中细菌含量少，且阳性率较低，一定程度上限制了其应用，很多学者借助MALDI-TOF MS积极寻找有效且快速的检测方法[11-13]。为缩短药物敏感性试验的报告时间，本研究在分离胶-质谱法快速鉴定结果的基础上，以增菌后分纯取菌的鉴定和药物敏感性试验为常规方法，并以此为标准，采用纸片扩散法、微量肉汤稀释法和仪器法分别对快速鉴定和药物敏感性试验结果的一致性进行评估。

本研究发现，常规培养与血培养瓶增菌培养脑脊液样本临床常见细菌的报阳时间差异无统计学意义（P=0.119），而真菌的报阳时间差异有统计学意义（P=0.002），这可能与2种方法的培养时间不同有关。另外，本研究还发现，常规培养的阳性率较血培养增菌培养低，且差异有统计学意义（P=0.000），与文献报道[3]相符。本研究中，血培养瓶增菌法对难培养的真菌，尤其是隐球菌的检出率明显提高，提示脑脊液血培养瓶增菌法不但未影响其报阳时间，还提高了总体阳性率及真菌的检出率，证实了脑脊液血培养瓶增菌法的优越性。

本研究中，直接离心富集的快速法与常规法相比，能快速鉴定脑脊液血培养阳性样本中的绝大多数病原菌，且2种方法鉴定结果符合率达89.80%，差异无统计学意义（P＞0.05）。快速法与常规法鉴定结果比较发现，直接离心集菌后采用MALDI-TOF MS鉴定革兰阴性菌的符合率优于革兰阳性菌，可能与革兰阳性菌壁厚、菌体小有关，与李媛睿等[14]的报道基本一致。方毅等[15]、马坚等[16]在血培养快速鉴定中也报道了相似的鉴定结果。本研究脑脊液血培养鉴定的隐球菌所占比例较高，可能与医院收治患者类型有关。综上所述，本研究认为直接使用报阳样本沉淀物快速鉴定的结果准确、可靠。

以常规转种培养法的药物敏感性试验结果为参考，本研究主要比较了革兰阴性菌、革兰阳性球菌及隐球菌的直接离心法快速药物敏感性试验结果，发现快速药物敏感性试验与常规药物敏感性试验结果高度一致，提示快速药物敏感性试验的结果在指导临床抗菌药物使用方面有较大的参考价值。另外，为检验快速药物敏感性试验（快速微量肉汤稀释法和快速仪器法）结果的准确性，本研究以纯培养微量肉汤稀释法为标准，快速微量肉汤稀释法和快速仪器法的标准一致率分别为98.56%和97.83%，显示快速药物敏感性试验结果具有较高的临床可信度。

常规转种过夜孵育取菌的药物敏感性试验是推荐方法，其结果准确、可靠。但是采用常规操作流程，从阳性报警到药物敏感性试验报告结果用时较长。有研究发现抗菌药物治疗延迟会造成患者病死率上升、住院日延长和医疗费用增加等严重后果[17]。本研究中，将脑脊液注入血培养瓶后，阳性率及培养菌株的多样性有明显优势，结合直接取菌后采用MALDI-TOF MS快速鉴定结果，脑脊液增菌培养阳性样本的快速与常规药物敏感性试验结果高度相符，大大缩短了报告时间，对临床用药提供了快速、准确的依据。本研究也存在一定局限性，收集样本量偏少，可能使结果不够全面，后续将增加样本量及菌种的多样性进行进一步的研究。