高效液相色谱分析中的样品前处理

◎ 田一茗

（咸阳市食品药品检验检测中心彬长旬区域分中心，陕西 咸阳 713500）

近年来，消费者对于食品安全问题越来越重视，国家对食品安全的监管力度不断加强。食品检测作为食品安全监管的技术支撑，其检测结果的准确性对于食品监管至关重要。食品检测技术不断发展，其中液相色谱分析法使用广泛，是目前食品检测领域最主流的技术手段之一。

一方面，由于食品生产工艺的不断进步以及监管部门加大监管力度且食品中的目标组分含量越来越少，对检测过程中样品处理技术的要求越来越高，加大了检测人员工作的难度。另一方面，在食品检测过程中，能够直接进入液相色谱仪分析的样品极少。因此，选用合适的样品前处理方法在液相色谱分析中尤为重要。

1 样品前处理的重要性

样品前处理是整个仪器分析实验环节从采样到数据处理中相当关键的一环，也是仪器分析中操作最复杂、最耗时的部分。液相色谱分析中样品前处理的重要意义概括来说有以下几个方面。①样品的基质过于复杂，影响了目标组分的测定。由于食品的配料以及加工工艺等原因，其所含成分复杂，可能会出现与目标组分性质相似的干扰成分，导致与被测组分的峰分离不完全或者出峰时间接近无法判断，检测人员需要通过预处理减少杂质干扰、改善分离效果。②样品中目标组分的含量过低，远远低于色谱仪的检出限，无法准确测得目标物含量，需要通过提取、富集、浓缩等预处理方法提高检测的灵敏度。③样品中含有的某些物质，破坏色谱柱。通过样品的前处理，可以除去对色谱柱有破坏的物质，如强酸、强碱、微生物分子以及提取时的强极性溶剂，延长色谱柱的使用寿命。④由于前处理的步骤繁杂，在处理过程中方法不得当或者忽略某一操作，会使加标回收率偏低，目标物质定性错误，出现结果偏离。

2 样品的前处理技术

2.1 蒸馏技术

蒸馏技术是利用液体混合物中不同组分的沸点不同将目标组分分离的前处理技术。实验室常用的蒸馏方法有水蒸气蒸馏、减压蒸馏以及常压蒸馏。①水蒸气蒸馏法。将待测样品与水共同蒸馏，目标组分与水共沸后随水蒸气分馏出来，是目前实验室常使用的提取方法之一，如食品添加剂丙酸盐的提取[1-2]。②减压蒸馏法。在常见的蒸馏装置中加入一个真空泵，使得蒸馏装置内的压力降低，降低了液体的沸点，用来分离或提纯沸点较高且热稳定性差的物质，如辣椒中苏丹红的提取。③常压蒸馏法。主要用于易挥发物质与不易挥发物质以及两种沸点相差较大的物质，除去待测样品中的干扰组分。

2.2 溶剂萃取技术

溶剂萃取萃取依据萃取对象的基质可分为液-液萃取、液-固萃取、液-气萃取，液液萃取是分析实验中常用到的萃取方式。液液萃取应用了相似相容原理，利用样品中不同组分在不混容的两种溶液中的分配比例不同，从而将目标组分从复杂基质中分离出来。例如蜜饯中色素赤藓红的提取[3]，将样品溶液与三正辛胺-正丁醇溶液混合，振摇后，待水相与有机相分层后，分取溶有目标组分的有机相进行后续实验操作。在实验操作中，检验人员应选择适当的溶剂进行萃取，一般遵守的溶剂选择原则是：①萃取溶剂与原来溶液中的溶剂不发生作用、互不相溶。②萃取溶剂对于待测组分的溶解度要比原溶液中的溶剂大得多。③萃取溶剂对待测组分溶解度大且对其他杂质的溶解度小，使待测组分从混合物中被有选择地分离开来。

2.3 超声萃取技术（SAE）

超声萃取技术就是在溶剂萃取时将其置于超声环境下进行，缩减了溶剂萃取的时间，提高萃取效率。在超声振动的过程中，所产生的能量被介质吸收转化成为热量使介质的温度不断增加到一定程度，这样的升温方式与传统的水浴加热所获得的效果不相上下，而且更加便捷。空化机制[4]是超声萃取技术的主动力，当超声波作用于液体且其所产生的声压足够大时，液体的平均分子间距不断加大，最终大于分子间的极限距离，这时液体中会产生微小气泡，这些微小气泡在高频率振荡下生长不断聚集声场能量，当所积聚的能量达到一定值，其空腔内部激烈收缩且崩溃，瞬间产生高压和高温，使液体中微粒的运动速度加快，使得萃取效率大大提高。超声技术不止应用在萃取中，在乳化、分散以及加速试剂溶解中都广泛应用，比传统的分液漏斗振荡和水浴振荡器操作更加便捷高效。

2.4 固相萃取技术（SPE）

固相萃取技术是目前液相色谱分析中运用最广泛的样品前处理萃取技术，如黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A等真菌毒素类以及其他农残检验项目的样品前处理都有采用固相萃取技术。固相萃取利用固体吸附剂将样品中的干扰物质与目标组分分离开来。基本原理：样品经过处理后成为样液，通过有吸附剂填充的萃取小柱，目标组分和干扰杂质被吸附，然后利用选择性溶剂去掉杂质，用洗脱溶剂洗脱出目标组分，浓缩、过滤后上机测定。操作步骤如下。①活化。一方面为了除去吸附剂中可能存在的与吸附相互作用且比目标组分更强的杂质，另一方面可以使吸附剂填料湿润，否则会使目标组分过早流出萃取小柱，导致最终结果偏低。不同萃取小柱在使用活化溶剂时应当注意，非极性类的、反相固相萃取柱和离子交换柱用到的活化溶剂应易溶于水，如乙腈、甲醇、丙酮等，再用水或者缓冲溶液洗去残留的有机溶剂。极性的正相固相萃取小柱通常用非极性溶剂进行活化，因为极性溶剂会与填充物中的极性物质键合，减小了目标组分与填充物的作用面积，导致回收率低。②上样。应当注意加入萃取柱中的样品体积应与填充物用量相匹配，否则就减少加入小柱内样品的体积。样品流速应当适合，不可过快，尽可能保证所有的目标组分能够有充分的时间被吸附剂吸附。③淋洗。用极性较弱的溶剂除去吸附在萃取柱中的干扰化合物，对于反相萃取柱来说，一般用含适量有机溶剂的水溶液或者缓冲溶液来淋洗。④洗脱。使用强度合适的洗脱剂将目标组分完全洗脱下来，经过氮吹、浓缩后复溶。为了获得较高回收率的同时，使用尽量少的洗脱溶剂，检验人员可以通过条件实验来选择洗脱溶剂的用量和强度。确定一个最佳的洗脱方式，不但能够最大限度地洗脱目标组分，也可以使干扰组分能够不被洗脱下来，而且减少了浓缩体积，提高实验效率。

2.5 衍生化技术

在液相色谱分析中，部分目标组分不能够直接被分离、检测或者对检测器响应值低甚至无响应时，使用衍生化试剂（具有特殊官能团的试剂）与之反应，将这种官能团引入到目标组分中，使其容易被分离或检测。衍生化技术分为柱前衍生化和柱后衍生化。柱前衍生是将多组分样品先通过衍生化反应生成衍生化产物，进入色谱柱分离后，进入检测器进行分析。但是，柱前衍生比较突出的缺点是把复杂组分衍生化后，可能会生成多种衍生化产物，不利于色谱分离，加大了色谱分离的难度。而柱后衍生化技术[5]改变了衍生化反应和色谱分离的先后顺序，克服了柱前衍生中多种衍生化产物引起的色谱分离效果不好的困难。相较于柱前衍生反应时间短、操作简便、重现性良好、分析自动化更高，因此被广泛应用。柱后衍生是将多组分样液通过色谱柱在一定色谱条件下分离并流出色谱柱后，各组分分别与衍生化试剂反应，得到的衍生化产物又重新进入检测器进行分析。比较常用的方法有荧光检测的衍生化、紫外-可见检测的衍生化以及电化学衍生化[6]。在黄曲霉毒素B1检测过程中就用到了高效液相色谱-柱后衍生法，国家标准GB 5009.22—2016[7]中规定了3种检测方法溴或碘试剂衍生、电化学衍生、光化学衍生。实验中，采用光化学柱后衍生法，黄曲霉毒素B1分子上的活性双键在紫外光的照射下发生羟基化反应，生成荧光强度更高的物质。这种方法在不使用任何试剂的情况下，有效解决了黄曲霉毒素B1因响应值过低而达不到仪器检测要求的问题。

3 样品前处理的发展趋势

样品前处理技术在不断发展的过程中，需要寻求的是一种比传统技术和现有技术更加高效、更加环保且回收率高、重现性好的处理技术。近几年，样品前处理技术自动化迅速发展。自动化仪器比起传统手工操作，不仅效率高而且结果好。例如，浓缩过程中，氮吹仪的自动化，省去了手动调节试管高度，避免了因人工操作不稳导致的溶液外漏。还有，固相萃取从最初的手动单个样品处理以及自制萃取柱，到后来的可以批量处理的固相萃取装置，通过与真空泵的连接来调节液体流速，以及固相萃取柱的商品化，如免疫亲和柱、分子印迹柱、净化柱等，再到全自动固相萃取仪，可以萃取、浓缩一体操作。各种样品前处理仪器的自动化在样品前处理环节中，不但将复杂烦琐的操作变得简便快捷，而且还能在处理过程中减少有毒有害试剂、气体对检验人员造成的身体伤害以及对环境的污染。如今，传统的前处理技术已经不再满足当下的检验需求，探索和学习前沿技术不仅是提高实验效率的手段，更成为未来样品前处理技术发展的新趋势。

4 结语

样品前处理是目前色谱分析中的关键环节，也是操作相对较为困难的环节。想要得到较好的回收率，在样品的前处理阶段就需要选择与目标组分性质相匹配的前处理方法，所选方法是否适用直接决定了检测结果的准确性。近年来，各种新型的前处理技术不断发展、设备不断更新，除了现有技术的学习使用外，检测人员也应加强新技术的学习，不断提高检测能力。